QQ交談
您所在位置：請輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://sorrent.com.cn/st236594/
推薦：PCR擴增產(chǎn)物的檢測分析
最近更新時間：2015-12-9
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：48.3KB
文件類型：PNG 圖片下載次數(shù)：138次
資料類型：瀏覽次數(shù)：1444次
PCR擴增反應完成之后,，必須通過嚴格的鑒定,，才能確定是否真正得到了準確可靠的預期特定擴增產(chǎn)物。凝膠電泳是檢測PCR產(chǎn)物常用和zui簡便的方法,，能判斷產(chǎn)物的大小,，有助于產(chǎn)物的鑒定,。凝膠電泳常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者,，后者主要用來檢測小片段DNA,。
1．瓊脂糖凝膠電泳
這是實驗室zui常用的方法，簡便易行,，只需少量DNA即可進行實驗,。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由于泳動速度不同而被分離,，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色,，在紫外光照射下DNA分子發(fā)出熒光而判定其分子的大小。
用于電泳檢測PCR產(chǎn)物的瓊脂糖濃度常為1%—2%,，應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖,，這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質(zhì)。
（1）制膠
瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm,。過薄則加樣孔樣品會溢出來，過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨,。如配制2%凝膠100ml,，稱取瓊脂糖2g于三角瓶中，加入100ml 0.5×TBE液,，微波爐加熱2-5min,，使瓊脂糖*溶解（注意不要暴沸），置室溫等溫度下降至60℃時,，加入終濃度0.5μg/ml的EB液,，充分混勻后倒板（注意排除氣體）。
（2）加樣和電泳
上樣時一般取pcr反應液5~10μl,，加入3μl溴酚蘭液,，充分混勻，加入凝膠加樣孔中,。電泳儀可用一般穩(wěn)壓可調(diào)中壓電泳儀,，電泳工作液為0.5×TBE液，接通電源,，使樣品由負極向正極移動,。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。
（3）檢測
將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺上進行檢測,，DNA產(chǎn)物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物,。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現(xiàn)，并與擴增時所設的陽性對照比較,，判斷陽性或陰性結(jié)果,。也可在電泳時以標準分子量作對照,，判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。
2,、聚丙烯酰胺凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣,，但在引物純化、PCR擴增指紋圖,、多重PCR擴增,、PCR擴增產(chǎn)物的酶切限制性長度多態(tài)性分析時常用到。
它與瓊脂糖凝膠電泳比較具有如下優(yōu)點：
①分辨率很強,，可達1bp,；
②能裝載的DNA量大，達每孔10μgDNA,；
③回收的DNA純度高,；
④其銀染法的靈敏度較瓊脂糖中EB染色法高2~5倍；
⑤避免了EB迅速退色的弱點,，銀染的凝膠干燥后可長期保存,。
聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍：
(1)制膠
在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片，放上制膠架,，擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板,。
制備適量合適濃度的凝膠，使之略多于膠板,。制備100μl體積凝膠的配制方法見下表,。
不同濃度（%）聚丙酰胺凝膠的制法：
試劑
3.5%
5%
8%
12%
20%
30%丙烯酰胺溶液（ml）
11.6
16.6
26.6
40
66.6
水（ml）
67.7
62.7
26.6
40
66.6
5×TBE（ml）
20
20
20
20
20
10%過硫酸銨（ml）
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
TEMED（ml）
0.035
0.035
0.035
0.035
0.035
在加入TEMED和10%過硫酸銨后，立即混勻,，倒入放置45℃角的玻璃板內(nèi),，*注滿（注意不要有氣泡），迅速將玻璃板放置水平位置,。立即放成型梳子于腔頂并夾緊,，待30-60分鐘膠聚合后，取下膠板,，放入電泳槽中固定,。
（2）加樣和電泳
上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液，溢過加樣孔,，拔出梳子,，排出加樣孔中的氣泡，將PCR產(chǎn)物或限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物2與1上樣緩沖液混勻,，用微量注射器加入加樣孔底部,，使樣品在孔底成一層，兩側(cè)孔中加入標準分子量的DNA Marker,。
以2-10V/cm電壓電泳,，電泳時間足夠長,，使片斷足以分開，待指示劑走到適宜位置時關(guān)閉電源,，將膠片取出,。
（3）銀染
分開兩塊玻璃板，將凝膠片放入100ml銀染固定液中振蕩15min,，雙蒸水洗3次,，每次2min，然后將凝膠片轉(zhuǎn)入100ml 0.2%的AgNO3中于搖床上染色約10min,，吸去AgNO3液,，用雙蒸水洗3次，每次30s,，加入100ml顯色液約7-10min,，待DNA帶顯示清除時，吸去顯色液,，加入固定液Na2CO3,，靜置2-3min，取出凝膠觀察,。