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質(zhì)粒DNA的微量制備
最近更新時間：2015-11-23
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實驗原理
質(zhì)粒（Plasmid）是一種雙鏈的共價閉環(huán)狀的DNA分子，它是染色體外能夠穩(wěn)定遺傳的因子,。質(zhì)粒具有復制和控制機構(gòu),，能夠在細胞質(zhì)中獨立自主的進行自身復制，并使子代細胞保持它們恒定的拷貝數(shù),。目前,，質(zhì)粒已廣泛的用作基因工程中目的基因地運載工具—載體。從大腸桿菌中提取質(zhì)粒dna,，是一種分子生物學zui基本的方法,。
質(zhì)粒DNA分離純化方法有多種，但其原理和步驟都大同小異,。本實驗著重介紹堿裂解法制備微量DNA,。
在EDTA存在的條件下，用溶菌酶破壞細菌細胞壁,，同時經(jīng)過NaOH和陰離子去污劑SDS處理,，使細胞膜崩解，從而達到菌體充分的裂解,。此時，細菌染色體DNA纏繞附著在細胞膜碎片上,，離心時易被沉淀出來,。而質(zhì)粒DNA則留在上清液內(nèi),，其中還含有可溶性蛋白質(zhì)、核糖核蛋白和少量染色體DNA,，實驗中加入蛋白質(zhì)水解酶和核糖核酸酶,，可以使它們分解，通過堿性酚（pH8.0）和氯仿－異戊醇混合液的抽提可以除去蛋白質(zhì),。異戊醇的作用是降低表面張力,，可以減少抽提過程中產(chǎn)生的泡沫，并能使離心后水層,、變性蛋白層和有機層維持穩(wěn)定,。含有質(zhì)粒DNA的上清液用乙醇或異丙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA,。
在實驗過程中,，由于細菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色體DNA容易被切斷成為各種大小不同的碎片而與質(zhì)粒DNA共同存在,，因此,，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有質(zhì)粒DNA外，還可能有少部分染色體DNA和RNA,，必要時可進一步純化,。
試劑和器材
一、試劑
1. LB 液體培養(yǎng)基
胰蛋白胨10g/L, 酵母浸膏5g/L,，NaCl 10g/L, 用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.5,，高壓滅菌。
2. TEG緩沖液（pH8.0 25mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L EDTA, 50mmol/L葡萄糖,，4mg/mL 溶菌酶）
稱取0.3g Tris加入0.1mol/L HCl溶液14.6mL,，先配制成pH8.0 Tris-HCl緩沖液100mL，再加入0.37g EDTA·Na2·2H2O和0.99g葡萄糖,，臨用前加入400mg溶菌酶,。
3. 堿裂解液（0.2mmol/L NaOH, 1% SDS）
稱取0.8g NaOH和1g SDS定容至100mL
4. 乙酸鉀溶液(pH8.0, [K+]=3mol/L, [Ac-]=5mol/L)
取60mL mol/L KAc加入11.5mL冰乙酸和28.5mL蒸餾水
5. 1mol/L pH8.0 Tris－HCl緩沖液
Tris 121.14g/L, 用鹽酸調(diào)至pH8.0