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植物RAPD分析技術(shù)
最近更新時間：2015-10-21
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RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA），意為隨機擴增多態(tài)性DNA,，是利用PCR技術(shù)進行隨機擴增,，把擴增的DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)DNA條帶的多態(tài)性來反應模板DNA序列上的多態(tài)性,。RAPD同AFLP,、SSR等分子標記一樣都基于PCR擴增，只是RAPD分析只需要一個引物,，其引物長度一般為10個核甘酸,，其序列是隨機的，不同核甘酸序列的引物均有商品出售,。
單引物擴增是通過一個引物在兩條DNA互補鏈上的隨機配對來完成,。由于基因組DNA的差異，使引物與模板的結(jié)合位點及這些位點之間的距離不同,，使PCR擴增后的片段大小表現(xiàn)出多態(tài)性,。在基因組DNA分子內(nèi)可能存在或長或短被間隔開的顛倒重復序列，如果這些序列與引物能堿基配對,，則在兩條單鏈上就會出現(xiàn)該引物的結(jié)合位點,，結(jié)合位點的數(shù)量取決于這種重復序列的多少。不同DNA分子中這種顛倒重復序列間隔的長短不同,，擴增條帶的大小就不同,，即表現(xiàn)出多態(tài)性。
10堿基引物理論上有410 種組合,，不同引物檢測的模板序列不同,，用足夠多的引物可覆蓋基因組全序列,，檢測位點多，可以在*不知道分子生物學背景的情況下對基因組進行分析,，是研究植物系譜關(guān)系,、起源與進化、遺傳多樣性及分子標記輔助育種的簡單易行的方法,；此外,，外源基因轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株相比,，外源基因插入的部位導致基因組DNA序列不同或重排,，當引物適宜時，擴增條帶的長短就會不同,，RAPD技術(shù)可以檢測出對照植株和轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR產(chǎn)物帶型的區(qū)別,。
由于隨機引物短，與模板結(jié)合的退火溫度低,，易出現(xiàn)堿基錯配,，因此在實驗中要嚴格操作程序及條件，使RAPD分析的結(jié)果較為穩(wěn)定,。因其費用較低,，方便易行，模板DNA用量少,，不需要同位素,，安全性好，繼RFLP之后得到廣泛應用,；且操作上比AFLP,、SSR等分子標記較為簡便易行，因此,，多數(shù)種類的栽培植物在資源多樣性,、分子標記等方面都有大量RAPD的研究報道。
本實驗目的是學習RAPD技術(shù)的原理,，掌握RAPD的操作及分析方法,。
一、試材及用具
試材:植物基因組DNA,。
用具:PCR儀,，1μL、10μL,、20μL,、100μL微量移液器及吸管，PCR管（200μL或500μL）及管架,，1.5 mL離心管及管架,，離心機,，記號筆，磁力攪拌器,，高壓滅菌鍋，電泳儀,，電泳槽,，電爐，三角瓶,，紫外透射儀,、凝膠成像系統(tǒng)。
藥品:10核苷隨機引物,、dNTP,、瓊脂糖、耐熱DNA聚合酶［TagDNA聚合酶,，與酶一起的還有兩種藥品,，分別是10× PCR Buffer（500 mmol/LKCL、pH 9.0的100 mmol/L Tris-Cl,、1.0%Tritonx?100）和25 mmol/L MgCl2,。
其他的藥品和緩沖液有:
10 mg/mL的溴化乙錠（EB）貯存液:在100 mL蒸餾水中加入1g EB，在磁力攪拌器上攪拌數(shù)h,，使其*溶解,，轉(zhuǎn)至棕色瓶中避光4 ℃保存。EB是強誘變劑,，稱量時要戴手套和口罩,。一旦接觸了EB，立即用大量水沖洗,。
1× TAE電泳緩沖液:50× TAE濃縮貯存液含Tris堿242g,；冰醋酸57.1 mL；pH 8.0的0.5 moL/L EDTA 100 mL,；加600 mL蒸餾水,，在磁力攪拌器上攪拌，zui后加蒸餾水定容至1000 mL,。
6× 凝膠加樣緩沖液:0.25%溴酚藍,，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液,，4℃保存,。
二、方法步驟
（一） 高壓滅菌
把所用的吸頭,、PCR管,、離心管等用具在高壓滅菌鍋中121℃（約1.1 kg/cm2 ）高壓滅菌30 min,。
（二）PCR反應物的混合
所用反應體系為:25μL反應體系中，10× PCR Buffer2.5 μL,，2.0 mmol/L MgCl2 ,，0.2 mmol/L dNTP,，各引物0.1 μmol/L,，TaqDNA酶1.5 U,，各品種DNA模板濃度為20~50 ng，加重蒸水（dd H2O）補充到25 μL,。
按照該反應體系,，先在1.5 mL離心管中冰浴混合除模板以外的各成分，充分混勻,，稍離心,，分裝到各PCR管中，然后把各品種的DNA模板分別加入到各管中,，蓋嚴管蓋,，在管外壁上做好標記，稍離心,，放入PCR儀中,。
（三）PCR擴增
PCR反應在DNA擴增儀中進行，所用程序為,，94℃預變性4 min,，94℃變性30 s，36℃退火30 s,，72℃2 min,，44個循環(huán)后72℃延伸10 min。反應結(jié)束后, 取出管子,，置4℃冰箱中保存,。
注意問題。在進行大量擴增前需對該物種確定擴增的優(yōu)化體系,，尤其是沒有文獻報道過的植物種類,，如Mg2+ 適宜的濃度，TaqDNA酶的用量,，退火溫度等,，各因子設計出梯度，通過檢測擴增帶的穩(wěn)定性和亮度來確定優(yōu)化的反應體系,。
（四）瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物
制膠,。根據(jù)PCR反應管的數(shù)量和電泳槽的大小估算瓊脂糖膠的體積，稱1.6~2.0 %的瓊脂糖溶解于1×TAE電泳緩沖液中，在電爐上加熱使瓊脂糖充分溶解,，待溶液溫度降到60℃,，加入EB，使EB的終濃度為1 μg/mL,，搖勻,，倒入帶有梳子的膠床中，避免產(chǎn)生氣泡,，室溫下約30 min膠自然凝固,。
點樣。取出擴增DNA的管子,，取7 μL擴增產(chǎn)物與2μL加樣緩沖液混合；輕輕拔出瓊脂糖膠上的梳子,，把瓊脂糖膠放入電泳槽中,，倒入1× TAE電泳緩沖液使液面高出膠面約1 cm；移液器插上10 μL吸管吸入DNA樣品后,，插入加樣孔底部,，緩慢把DNA樣品加入到點樣孔中。
電泳,。加樣完畢后,，正確連接電泳槽和電源，黑線連陰極,，紅線連陽極,，打開電源，正確設定電壓及時間,，時間的選擇取決于膠的長度和電壓大小,。一般用不高于5v/cm的電壓，電泳約2 h,，待溴酚藍離膠邊約1~1.5 cm時停止電泳,。
檢測和照相。小心取出凝膠,，置于紫外透射儀上,，紫外燈下檢測擴增片段的有無及分離情況，在凝膠成像儀上照相,，圖片保存于計算機中,，待統(tǒng)計分析。
注意問題,。兩電極間電壓不應超過5v/cm,，電壓越高，遷移越快，但分離效果相對較差,；擴增帶如果不是細亮清晰而呈形狀模糊或條帶粗亮相連,，可能是DNA加樣量太多或電壓過高或瓊脂糖濃度偏低等，在重新電泳時做適當?shù)恼{(diào)整,。
（五）RAPD條帶分析
把RAPD每個反應重復2次,。以兩次重復中穩(wěn)定出現(xiàn)的亮帶作為統(tǒng)計對象，有電泳帶記為1,，無電泳帶記為0,，錄入計算機Excel表格中。利用STATISTIC軟件,，采用UPGMA方法（非加權(quán)類平均法:Unweighted Pair Group Method using Arithmetric Averages）對所用品種或材料進行聚類分析,。S為兩樣品間的遺傳相似度，D為遺傳距離,，S=2Nxy/(Nx+Ny),，D=1-S，Nxy為本兩個樣品共享的RAPD標記數(shù),，Nx,、Ny分別為X樣品和Y樣品分別具有的RAPD標記數(shù)。
注意問題,。對電泳結(jié)果的判讀同PCR條件是否優(yōu)化及引物數(shù)量是否足夠等一樣,，會影響RAPD 結(jié)果的可信度。對電泳結(jié)果的判讀主要是一些弱帶的取舍問題,，弱帶取舍主要看其重復出現(xiàn)的幾率,，可進行重復實驗；也可在難取舍的弱帶位置上出現(xiàn)的電泳條帶都不統(tǒng)計,，這樣可能丟失了一些多態(tài)性信息位點,，對研究材料的系譜關(guān)系等影響不大，但當研究分子標記或構(gòu)建基因連鎖圖譜時就不可取,。