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外源DNA和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)
最近更新時間：2015-8-28
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外源ＤＮＡ片段和線狀質(zhì)粒載體的連接,，也就是在雙鏈ＤＮＡ５"磷酸和相鄰的3"羥基之間 形成的新的共價鏈,。如質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶5"磷酸，可生成４個新的磷酸二酯鏈,。但如果質(zhì)粒ＤＮＡ已去磷酸化,，則吸能形成２個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產(chǎn)生的兩個雜交體分子帶有２個單鏈切口,，當(dāng)雜本導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù),。相鄰的５"磷酸和３"羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的ＤＮＡ連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶,。實(shí)際上在有克隆用途中,，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶都是的用酶。這是因為在下沉反應(yīng)條件下,，它就能有效地將平端ＤＮＡ片段連接起來,。
ＤＮＡ一端與另一端的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下,，其反應(yīng)速度*由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定,。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內(nèi)連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此?，F(xiàn)考慮一種簡單的情況,，即連接混合物中只含有一種ＤＮＡ，也就是用可產(chǎn)生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體ＤＮＡ,。在瓜作用的底物,。如果反應(yīng)中ＤＮＡ濃度低，則配對的兩個末端同一ＤＮＡ分子的機(jī)會較大（因為ＤＮＡ分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）,。這倦,，在ＤＮＡ濃度低時，質(zhì)粒ＤＮＡ重新環(huán)化將卓有成效,。如果連接反應(yīng)中ＤＮＡ濃度有所增高,，則在分子內(nèi)連接反應(yīng)發(fā)生以前，某一個ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大,。因此在ＤＮＡ濃度高時,，連接反的初產(chǎn)物將是質(zhì)粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷,，第２,、３期合刊)從理論上探討了ＤＮＡ濃度對連接產(chǎn)物性質(zhì)的影響。簡而言之,，環(huán)化的連接產(chǎn)物與多聯(lián)體連接產(chǎn)物的比取決于兩個參數(shù)：j和i,。j是ＤＮＡ分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數(shù)值是根據(jù)如下一種假設(shè)作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈隨機(jī)卷曲,。這樣,，j與ＤＮＡ分子的長度成反比（因為ＤＮＡ越長,，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對給定長度的ＤＮＡ分子來說是一個常數(shù),，與ＤＮＡ深度無關(guān),。j＝[3/(3πl(wèi)b0)]3/2其中l(wèi)是ＤＮＡ長度，以cm計,，b 是隨機(jī)卷曲的ＤＮＡ區(qū)段的長度,。b的值以緩沖液的離子強(qiáng)度為轉(zhuǎn)移，而后者可影響ＤＮＡ的剛度,。
i是溶液中所有互補(bǔ)末端的深度的測量值,，對于具有自身互補(bǔ)粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里Ｎo是阿佛伽德羅常數(shù),，Ｍ是ＤＮＡ的摩爾濃度（單位：mol/L）,。理論上，當(dāng)j=i時,，給定ＤＮＡ分子的一個末端與同一分子的另一末端,，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下,，在反應(yīng)的初始階段中，環(huán)狀分子與多聯(lián)體分子的生成速率相等,。而當(dāng)j>i時,，有利于重新環(huán)化；當(dāng)i>j,，則有利于產(chǎn)生多聯(lián)體,。圖1.9顯示了ＤＮＡ區(qū)段的大小與連接反應(yīng)混合物中j:i之比分別為0.5、1,、2和5時所需ＤＮＡ濃度之間關(guān)系（Ｄugaiczyk等,， 1985）。 現(xiàn)在考慮如下的連接反應(yīng)混合物：其中除線狀質(zhì)粒之外,，還含有帶匹配末端的外源ＤＮＡ片段,。對于一個給定的連接混合物而言，產(chǎn)生單體環(huán)狀重組基因組的效率不僅受反應(yīng)中末端的濃度影響,， 而且還受質(zhì)粒和外源ＤＮＡ末端的相對濃度的影響,。當(dāng)i是j的２－３倍（即末端的濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時）外源ＤＮＡ末端濃度的２倍時,，有效重組體的產(chǎn)量可達(dá)到zui大,。這些條什下，連接反應(yīng)終產(chǎn)物的大約40％都是由單體質(zhì)粒與外源ＤＮＡ所形成的嵌合體,。當(dāng)連接混合物中線瘃質(zhì)粒的量恒定（j:i=3）而帶匹配末端的外源ＤＮＡ的量遞增時,，這種嵌合體在連接反應(yīng)之末的理論產(chǎn)量,。