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士鋒細(xì)菌中蛋白質(zhì)的提取與純化技術(shù)
最近更新時間：2015-7-24
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：50.6KB
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一,、實(shí)驗(yàn)試劑
采用T7 Tag Affinity Purification Kit
T7 Tag抗體瓊脂,。B/W緩沖液：4.29 mM Na2HPO4，1.47 mM KH2PO4,，2.7 mM KCl,， 0.137 mM NaCl，1%吐溫-20,，pH7.3 洗脫緩沖液: 0.1 M檸檬酸,，pH2.2 中和緩沖液：2 M Tris，pH10.4,。 PEG 20 000,。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 100 ml 含重組表達(dá)質(zhì)粒的菌體誘導(dǎo)后,，離心5 000 g×5 min,，棄上清，收獲菌體,，用10 ml預(yù)冷的B/W緩沖液重懸,。
2. 重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4℃離心 14 000 g×30 min,，取上清液,，0.45 μm膜抽濾后作為樣品液。
3. 將結(jié)合T7 Tag抗體的瓊脂充分懸起,，平衡至室溫,，裝入層析柱中。
4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱,。
5. 10 ml B/W緩沖液過柱,，洗去未結(jié)合蛋白。
6. 用5 ml洗脫緩沖液過柱,，每次1 ml,，洗脫液用含150 μl中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上,，直接SDS-PAGE分析,。
7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24 h,，中間換液數(shù)次,。
8. 用PEG 20000濃縮蛋白。
三,、注意事項(xiàng)
蛋白在過層析柱前,，要0.45 μm膜抽濾，否則幾次純化后,，柱子中會有不溶物,。