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士鋒聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定IgG純度
最近更新時間：2015-7-7
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：214.3KB
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一）原 理
由于聚丙烯酰胺凝膠的濃度可以按要求配制,，因此可以形成“連續(xù)系統(tǒng)"和“不連續(xù)系統(tǒng)"兩種電泳系統(tǒng),?！安贿B續(xù)系統(tǒng)"zui大的特點在于大大提高了樣品分離的分辨率。這種電泳的主要特點是：（1）使用兩種不同濃度的凝膠系統(tǒng),；（2）配制兩種凝膠的緩沖溶液成分及pH不同,，并且與電泳槽中電泳緩沖液的成分、pH也不相同,。在實驗中,，電泳凝膠分為兩層：上層膠為低濃度的大孔膠,，稱為濃縮膠或成層膠,，配制此層膠的緩沖液是Tris-HCl，pH6.7,；下層膠則是高濃度的小孔膠,，稱為分離膠或電泳膠，成膠的緩沖液是Tris-HCl,，pH8.9,。電泳槽中的電極緩沖液則是Tris-甘氨酸，pH8.3,?？梢姡z濃度,、成膠成分,、pH與電泳液緩沖系統(tǒng)各不相同，形成了一個不連續(xù)系統(tǒng),。
電泳時,，蛋白質樣品放置在濃縮膠上，為防止蛋白質樣品在電極緩沖液中擴散,，因而加入等體積的40%蔗糖或50%甘油與之混合,，以提高密度；為觀察蛋白質樣品泳動的情況,，樣品中還加入溴酚藍等示蹤染料,，這些有色物質的分子比任何一種大分子物質泳動的速度都快，只要染料未泳動出凝膠管,，樣品就沒有走出膠管的危險,。
在不連續(xù)系統(tǒng)中，當接通電源開始電泳時,，系統(tǒng)中的甘氨酸,、蛋白質、HCl中的氯離子和溴酚藍等均解離為陰離子,，形成離子流向陽極泳動,。其遷移率取決于離子的電荷數(shù),、分子量大小及形狀。然而,，當電極緩沖液（pH8.3）中的甘氨酸離子在進入濃縮膠時,，它們遇到了比pH8.3低的pH(6.7)，pH下降了近兩個單位,，幾乎接近于甘氨酸的等電點（5.97）,，于是甘氨酸的解離度突然降低，所帶電荷量明顯減少,，遷移率減慢,。血清樣品中個蛋白質成分也進入濃縮膠，pH的改變雖對其解離度有影響,，但比對甘氨酸要小得多,，其遷移率比甘氨酸要大，而且濃縮膠的膠孔較大對蛋白質分子不會造成阻礙,。濃縮膠中的Tris-HCl中的Cl-則全部解離,，分子量很小，摩擦力不大,，其遷移率比蛋白質,、溴酚藍都快。于是在濃縮膠中各種離子的遷移率形成：甘氨酸<蛋白質<溴酚藍<Cl-的順序,。
甘氨酸分子進入濃縮膠后解離度的下降,，造成移動離子流的突然缺失，出現(xiàn)電流減小電導率下降,。然而,，整個電泳系統(tǒng)中其他部分的電流仍維持不變，根據(jù)電導及電位梯度成反比（E=I/n,，E為電位梯度,，I為電流強度，n為電導率）的關系,，于是在前導離子Cl-離子與慢離子甘氨酸離子之間突然形成了較高的局部電位梯度,。處在這個局部高電位梯度區(qū)域中的血清蛋白質各成分，在高電場作用下迅速以不同的速度（分子量不同,、帶電量不同）泳向前導Cl-離子區(qū)域,。當?shù)竭_前導Cl-區(qū)域時因不缺少離子，大的電場強度減弱,，離子移動速度急速減慢下來,，其結果在甘氨酸和Cl-離子之間的蛋白質樣品就按其分子的大小堆積或濃縮成層。通過這個過程，是蛋白質樣品濃縮了好幾百倍,，且蛋白質各成分也按一定的順序排列成層,。
當離子流繼續(xù)向前，進入以pH8.9緩沖液配制的小孔膠時,，蛋白質分子在小孔膠里遇到阻力,，遷移率減慢，同時在pH8.9條件下,，甘氨酸又充分解離,，其帶電量增加，消除了離子流缺失的現(xiàn)象,，小分子的甘氨酸離子趕上了蛋白質,。凝膠各部分恢復具有恒定的電場強度，蛋白質的分離*按一般區(qū)帶點用方式進行,。
由以上的原理可見,，聚丙烯酰胺凝膠的不連續(xù)電泳zui主要的優(yōu)點就是使蛋白質樣品經(jīng)濃縮膠后,，形成緊密地壓縮層進入分離膠,。蛋白質各成分預先分開且壓縮成層，可以減少在電泳時,，成分間由于自由擴散而造成的區(qū)帶相互重疊所帶來的干擾,，這樣就提高了電泳的分辨能力。由于這個優(yōu)點,，少量的蛋白質樣品（1-100??g）也能分離得很好,，分辨率高使血清蛋白質可獲得近20多個區(qū)帶。
（二）試劑和器材
1．測試樣品 血清蛋白,、脫鹽后的IgG,、純化后的IgG。
2．試劑
（1）制備分離膠,、濃縮膠有關試劑
① 凝膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml,，Tris（三羥基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N,，N,，N`，N`-四甲基乙二胺）0.23ml,，加重蒸水至80ml使其溶解,，調pH8.9，然后加重蒸餾水定容至100ml,，置棕色瓶,，4℃貯存。
② 分離膠貯液：28%Arc-0.735%Bis儲液：丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉雙丙烯酰胺（Bis）0.735g,，加重蒸水使其溶解后定容至100ml,。過濾后置棕色試劑瓶中，4℃ 貯存,，一般可放置1個月左右,。
③ 分析純過硫酸胺（AP）（AR） 0.14g加重蒸水至100ml，置棕色瓶,，4℃儲存僅能用一周,，當天配制。上述3種試劑用于制備分離膠,。
④ 濃縮膠緩沖液：稱取1mol/L HCl 48ml,，Tris5.98g，TEMED 0.46ml,，加重蒸水至80ml,調pH6.7,，用重蒸水定容至100ml，置棕色瓶內,，4℃貯存,。
⑤ 濃縮膠貯液：稱Acr10g，Bis2.5g 加重蒸水溶解后定容至100ml,，過濾后置棕色瓶內,，4℃貯存。
⑥ 40%蔗糖溶液（W/V）
⑦核黃素溶液 核黃素4.0mg,，加重蒸餾水溶解,，定容至100ml，置棕色試劑瓶內,，4℃貯存,。
（2）Ph8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液
稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g,加蒸餾水至900ml,，調pH8.3后,，用重蒸水定容至1000ml，置試劑瓶中,，4℃貯存,，臨用前稀釋10倍。
（3）0．1%溴酚藍指示劑
（4）染色液 染色液種類較多,，染色方法也不*相同,。本實驗采用0.05%考馬斯亮藍R250染色液中，含20%磺基水楊酸,，其優(yōu)點是染色,、固定同時進行,，背景易脫色。0.5%考馬斯亮藍R250的20%磺基水楊酸染色液：考馬斯亮藍0.05g,，磺基水楊酸20g,，加蒸餾水至100ml，過濾后置試劑瓶內保存,。
（5）脫色液 7%乙酸溶液
（6）保存液 甘油10ml,，冰乙酸7ml，加蒸餾水至100ml,。
（7）1%瓊脂（糖）溶液 瓊脂（糖）1g,，加已稀釋10倍的電極緩沖液，加熱溶解,，4℃貯存,，備用。
3．器材 電泳儀 夾心式垂直板電泳槽,。