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新穎的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)

最近更新時(shí)間：2015-4-1

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研究者們在分離到某一基因后，要對其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行研究zui理所當(dāng)然的工作就是表達(dá)――即：有目的性地合成外源基因產(chǎn)物,。在重組DNA技術(shù)的發(fā)展早期,，人們認(rèn)為在基因的前面有一個(gè)強(qiáng)啟動子和一個(gè)起始密碼子就足以在大腸桿菌中獲得很好的表達(dá)。隨后,，認(rèn)識到獲得有效的翻譯所需的條件要復(fù)雜得多,，除了要有強(qiáng)啟動子和起始密碼子外,，良好的表達(dá)尚需編碼目的蛋白的mRNA中含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，表達(dá)水平受密碼子喜好程度的影響,，也受編碼序列中其他目前尚未明了的因素影響,。通過改變起始密碼子前端的序列，或者在不改變蛋白質(zhì)序列的條件下利用密碼子的簡并性改變5’末端編碼序列往往有助于解決問題,。

通常,，兩個(gè)基因之間的融合表達(dá)能更快地解決這些問題。在這種方式中,，目的基因被引入某個(gè)高表達(dá)蛋白序列（fusion tag）的3’末端，比如大腸桿菌的一段序列,，或者任一可在大腸桿菌中高度表達(dá)的基因,，它提供良好表達(dá)所必需的信號，而表達(dá)出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag編碼的片段,。fusion tag所編碼的可能是整個(gè)功能蛋白或是其中的部分,。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白,、谷胱甘肽S^-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白以及硫氧還蛋白(Trx)融合蛋白等,。

由于利用tag的特性通常可以對融合蛋白進(jìn)行親和層析等分離提純,，更多情況下選擇融合表達(dá)是為了簡化重組蛋白的純化,。因此出現(xiàn)兩種融合表達(dá)類型：一是fusion tag位于目的蛋白的N端，這時(shí)tag可以提供良好表達(dá)所必需的信號,，幫助提高目的蛋白的表達(dá),，缺點(diǎn)是純化的表達(dá)產(chǎn)物中可能會有不完整的目的蛋白，原因是在翻譯過程中意外中斷的少量（C端）不完整的表達(dá)產(chǎn)物會一起被純化,。另一是fusion tag位于目的蛋白的C端,，這可以保證只有完整的表達(dá)產(chǎn)物才會被純化。當(dāng)目的蛋白的功能區(qū)位于N端時(shí),，fusion tag位于C端可能減少對其功能的影響,，反之亦然。

進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)經(jīng)常會遇到三個(gè)問題,，它們是：表達(dá)蛋白的溶解性,、穩(wěn)定性和fusion tag的存在。前兩個(gè)問題在融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)和非融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)都會遇到,，而第三個(gè)問題是融合蛋白系統(tǒng)所*的,。

裂解融合蛋白以除去fusion tag

為了對目的蛋白進(jìn)行生化及功能分析，通常要從目的蛋白上去除fusion tag部分,。早期已建立了數(shù)種對融合蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性裂解的方法,?；瘜W(xué)裂解如溴化氰(Met↓)、BNPS-3-甲基吲哚(Trp↓),、羥胺(Asn↓Gly)等,，不但便宜且有效，往往還可以在變性條件下進(jìn)行反應(yīng),。但由于裂解位點(diǎn)的特異性低和可能對目的蛋白產(chǎn)生的不必要修飾,，使該法漸漸被酶解法取代。酶解的方法相對來說反應(yīng)條件較溫和,，更重要的是,，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特異性。其中有用的酶有：Xa因子,、凝血酶,、腸激酶、凝乳酶,、膠原酶,。所有這些酶都具有較長的底物識別序列(如在凝乳酶中為7個(gè)氨基酸)，從而降低了蛋白質(zhì)中其他無關(guān)部位生斷裂的可能性,。而酶解法存在成本高（這些蛋白酶價(jià)格一般都相當(dāng)昂貴）,，反應(yīng)時(shí)間長等問題，更重要的是蛋白酶本身不可避免地會混入目的蛋白中,，造成新的污染,，提高純化的復(fù)雜性。

IMPACT系統(tǒng)的推出是融合表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)重大突破,。該系統(tǒng)zui大的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)的融合蛋白無需蛋白酶裂解即可實(shí)現(xiàn)目的蛋白與fusion tag的切割,。IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系統(tǒng)利用一個(gè)來源于枯草桿菌的5kDa大小的幾丁質(zhì)結(jié)合域（chitin binding domain，用于親和純化）和一個(gè)來源于酵母intein 蛋白質(zhì)組成一個(gè)雙效的fusion tag,，再與克隆到多克隆位點(diǎn)的目的基因融合表達(dá),。Intein是一個(gè)蛋白質(zhì)剪接元件，類似于基因組中的內(nèi)含子intron在RNA的剪接中所起的重要作用,，intein在較低的溫度和還原條件下發(fā)生自身介導(dǎo)的N端裂解,，可以釋放出與之相連的目的蛋白。也就是說融合表達(dá)產(chǎn)物在掛上親和層析柱后只需要在低溫（4度）條件下用含DTT,，或者巰基乙醇,，或者半胱氨酸的溶液洗脫，即可將目的蛋白洗脫,，而將fusion tag留在純化柱上,。而還原劑的小分子可以非常簡單的去除。該系統(tǒng)的出現(xiàn)是融合表達(dá)系統(tǒng)的重大突破,，*避免了蛋白酶的使用,，不但可以有效降低成本,，提率，也避免了蛋白酶與目的蛋白的分離純化的麻煩,。

隨后推出的IMPACT-CN系統(tǒng)提供了兩種選擇,，即fusion tag可以選擇在目的蛋白的C端或者N端，使克隆或表達(dá)都能滿足不同需要,。但是這一系統(tǒng)仍然有一個(gè)缺陷,，那就是含有較多二硫鍵的蛋白不適用這一系統(tǒng)，因?yàn)檫€原劑的存在會破壞/影響蛋白的二級結(jié)構(gòu),。

IMPACT―TWIN的推出為我們帶來了更大的驚喜,。在多克隆位點(diǎn)的兩端各有一段intein和幾丁質(zhì)結(jié)合域的fusion tag，提供了三種選擇：1,、在克隆時(shí)切掉N端的fusion tag 1,，插入目的基因，同原來的系統(tǒng)一樣,，可以在表達(dá)產(chǎn)物掛上親和純化柱后加入還原劑，將目的蛋白從fusion tag上解離并洗脫下來,，得到的目的蛋白C端帶有硫酯鍵,，可以直接用于連接一個(gè)標(biāo)記物、非編碼氨基酸或者另一個(gè)蛋白,；2,、在克隆時(shí)切掉C端的fusion tag 2并插入目的基因，當(dāng)表達(dá)產(chǎn)物掛上親和純化柱時(shí)只需要改pH值和溫度（pH7,25度）即可將目的蛋白從fusion tag上解離并洗脫下來,。這不但避免了蛋白酶的使用,，更重要的是也避免了還原劑對含豐富二硫鍵的蛋白二級結(jié)構(gòu)的破壞。由于調(diào)節(jié)緩沖液的pH值非常方便且無需另外去除洗脫產(chǎn)物中的還原劑,，這大大地簡化了目的蛋白的純化過程,，也擴(kuò)大了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。3,、可以將目的基因插入兩個(gè)fusion tag之間,，這樣表達(dá)產(chǎn)物的兩端都含有fusion tag，當(dāng)產(chǎn)物掛上親和純化柱并經(jīng)過兩級洗脫后,，由于目的蛋白兩端分別有一個(gè)硫酯鍵和半胱氨酸,，可以自身環(huán)化得到環(huán)形蛋白。

表達(dá)蛋白的可溶性

在大腸桿菌中許多外源蛋白的高水平表達(dá)zui后都會導(dǎo)致形成包涵體,，它是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚體,，含有大部分的表達(dá)蛋白。蛋白質(zhì)沉淀形成包涵體有利的一面是可以利用包涵體的不溶性和致密性,，通過超聲波破碎,、離心就能相對容易地對之進(jìn)行初級純化,。此外，以可溶性蛋白形式表達(dá)時(shí)往往易被降解的蛋白質(zhì),，以包涵體形式表達(dá)時(shí)卻可以很穩(wěn)定,。純化時(shí)，可用鹽酸胍或尿素變性溶解包涵體中的蛋白質(zhì),。透析除去變性劑后,，蛋白質(zhì)可重新折疊復(fù)性。然而這種方法亦有其弊端,，經(jīng)變性/復(fù)性后正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量不穩(wěn)定,，有時(shí)會很低，更有些蛋白尤其是大蛋白基本上不能正確進(jìn)行重折疊,。

當(dāng)包含體復(fù)性后的產(chǎn)量太低,，而所需表達(dá)的是可溶性蛋白時(shí)，有多種解決方法可供嘗試,。一個(gè)重要的變量就是溫度,，由于尚未明了的原因，高溫(37℃和42℃)會促進(jìn)包涵體形成,，低溫(30℃)的抑制其形成,；另一個(gè)變量是表達(dá)水平，有時(shí)降低表達(dá)水平可增加可溶蛋白比例,；第三個(gè)變量是攜帶表達(dá)載體的細(xì)胞株背景,，不同的受體菌株表達(dá)出的特定蛋白的可溶性有顯著的差異，但各株間究竟是何種遺傳差異決定了溶解性的差異仍屬未知,；zui后,，值得注意的是，改變fusion tag往往可以影響所表達(dá)的融合蛋白的溶解性,。

表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性

在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白,，尤其是真核蛋白時(shí)，經(jīng)常會遇到穩(wěn)定性的問題,。包含體有助于穩(wěn)定融合蛋白,；采用缺失已知蛋白酶的大腸桿菌株作為宿主也是解決的方法之一。比如,，缺失數(shù)種胞質(zhì)蛋白酶的lon htpR雙突變株可減少不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的降解,。與之相似的是，degP突變株可穩(wěn)定胞質(zhì)中的融合蛋白,、ompT突變株被證實(shí)在蛋白質(zhì)的粗提過程中能避免一些非融合蛋白中暴露的堿性氨基酸殘基之間的肽鍵發(fā)生斷裂(如Arg-Arg),。zui后，對于某一特定融合蛋白來說,，在不同的野生型實(shí)驗(yàn)株內(nèi)其穩(wěn)定性亦有差異,，可能歸因于不同株內(nèi)蛋白酶的水平不同,。

編輯： lwinna

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