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吖啶橙區(qū)分活細胞DNA和RNA的熒光組織化學染色法
最近更新時間：2015-1-30
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吖啶橙區(qū)分活細胞 DNA 和 RNA 的熒光組織化學染色法
吖啶橙《acridine oran。AO)屬于三環(huán)雜芳香類異嗜性陽離子熒光染料,，主要以兩種方式與核酸結(jié)合,，一是嵌入核酸雙鏈的堿基對之間；二是與單鏈核酸的磷酸發(fā)生靜電相互作用,。當吖啶橙與DNA或RNA結(jié)合時,，zui大發(fā)射波長分別為525nm或650nm，產(chǎn)生綠色熒光或橙紅色熒光,，因此,，吖啶橙是研究核酸的一種常用熒光組織化學 染料。下面介紹應(yīng)用吖啶橙區(qū)分活細胞和原位組織細胞DNA和RNA熒光組織化學染色法,。
1．溶液配制
(1)吖啶橙濃縮液(4℃、避光,，可保存數(shù)月)
雙蒸水 50ml
吖啶橙 50mg
(2)甲液
雙蒸水 200ml
HCl 16ml
NaCl 1．74g
Triton X-100 0．2ml
(3)乙液
0．2mol／LNa2HP04／0．1mol／L枸櫞酸緩沖液(pH 6．0)
雙蒸水 100ml
Na2 HP04?12H20 4．51g
枸櫞酸(無水檸檬酸) 0．71g
溶解后,，依次加入以下試劑和吖啶橙濃縮液
NaCl(0．15mol／L) 0．87g
EDTA-Na(1mmol／1) 0．037g
吖啶橙濃縮液 0．6ml
加入吖啶橙濃縮液后，應(yīng)盡早使用,。
2．操作程序
(1)取0．2ml含10％小牛血清的細胞懸液,，再與0．4ml冷“甲液"混合，振蕩15秒,；
(2)加入l.2ml"乙液",，充分混勻,；
(3)于10分鐘內(nèi)，熒光顯微鏡觀察,，激發(fā)波長為488nm,。
結(jié)果：DNA為黃綠色熒光，而RNA為橘紅色熒光,。如果同時進行DNA和RNA染色時,，需用鰲合劑處理，使雙鏈RNA變性,，確保所有的RNA均為單鏈,，而雙鏈DNA不受影響，增加結(jié)果的可信性,。鰲合劑以乙二胺四乙酸(EDTA)為佳,。