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細(xì)胞染色方法總結(jié)
最近更新時(shí)間：2015-1-12
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Hoechst染色：hoechst可以穿過(guò)活細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合有hoechest33342和hoechst33258兩種（主要為凋亡活細(xì)胞）在紫外光下將核染為藍(lán)色,。Hoechst染細(xì)胞核會(huì)影響共聚焦顯微鏡對(duì)該樣本其他熒光的觀察效果,。hoechsthoechsts33258，hoechst33342二者區(qū)別不大,，但是hoechst33342對(duì)細(xì)胞的毒性作用更小一些,，所以一般來(lái)說(shuō)hoechsts33258用于細(xì)胞固定后再染色，而hoechst33342則可以對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行染色,！染色步驟
PI（PropidiumIodide碘化丙啶）染色：是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色（PropidiumIodide,，PI）是一種核酸染料（紅試劑，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè),。碘化丙啶色）,，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性的增加,，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅,。
用PI單一染色觀測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞,，只能表示細(xì)胞的壞死情況，而不是凋亡（當(dāng)然晚期凋亡PI亦可著色）,。但是如果您只是想知道細(xì)胞的死亡情況,，而不是仔細(xì)區(qū)分壞死或凋亡，那么PI單一染色也可以,。但是如果您一定要認(rèn)定細(xì)胞的凋亡,，那么PI單一染色顯然不夠！
annexin-v染色細(xì)胞凋亡早期,，細(xì)胞膜標(biāo)志發(fā)生改變,。其中，磷脂酰絲氨酸（Annexin-V,，PS）外翻,，Annexin-V在Ca2+存在的條件下與其高親和力特異性結(jié)合。這樣,，Annexin-v染色陽(yáng)性,，表示細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài)。Annexin-V結(jié)合不同的熒光抗體,，就可以利用流式細(xì)胞儀,、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。AnnexinV用FITC標(biāo)記發(fā)綠色熒光,；如果用PE標(biāo)記就發(fā)紅色熒光,。
JC-1染色JC-1是一種陽(yáng)離子染料，可以在線粒體內(nèi)聚集,，低濃度時(shí)主要以單體（monomer）存在,，發(fā)射光以綠光（～525nm）為主；而在高濃度時(shí)則可以形成多聚體（aggregation）,，發(fā)射光以紅光（-590nm）為主,。線粒體本身存在一定的極性（polarization），其外膜為負(fù)極,，內(nèi)膜為正極,。電位差由Ca2+、Na+和H+流調(diào)控,。當(dāng)線粒體狀態(tài)良好時(shí)對(duì)JC-l攝取量少,，因而在線粒體內(nèi)主要以單體的形式存在綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度的比值較高。
在線粒體發(fā)生去極化（depolarization）時(shí),，線粒內(nèi)JC-l的濃度較高,，多以多聚體的形式存在，綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度的比值降低。JC-1染色的綠光強(qiáng)度/紅光強(qiáng)度僅取決于線粒體的膜電勢(shì)（membranepotential）,，而與線粒體的形態(tài),、體積和密度都無(wú)關(guān)，因而能更好地反映線粒體的功能狀態(tài),。由于凋亡發(fā)生的早期存在線粒體的去極性,，因此，JC-1染色被用于檢測(cè)凋亡的早期發(fā)生,。其實(shí)驗(yàn)方法如下,。
JC-l染色非常簡(jiǎn)單。首先可將成品JC-1以DMSO配成儲(chǔ)存液（1~5 mg/ml）,，儲(chǔ)存于-20℃,，用時(shí)以培養(yǎng)液稀釋至10 ug/ml 終濃度。對(duì)貼壁細(xì)胞可以直接棄去培養(yǎng)液,，漂洗細(xì)胞后直接加入染色液，10~30 min后在熒光顯微鏡下或者激光共聚焦下觀察,。線粒體狀態(tài)好時(shí)細(xì)胞以綠色為主,，當(dāng)紅光信號(hào)增強(qiáng)時(shí)，紅綠相疊,，以橙色為主,。該染色運(yùn)用于懸浮細(xì)胞時(shí)還可以通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，收集紅/綠信號(hào)強(qiáng)度,，計(jì)算其強(qiáng)度比,。
鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）：Calcein-AM本身并不是熒光分子，但通過(guò)活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用,，Calcein-AM能脫去AM基,，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光（激發(fā)：490 nm，發(fā)射：515 nm）,。因此Calcein-AM僅對(duì)活細(xì)胞染色