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大鼠間充質干細胞培養(yǎng)
最近更新時間：2015-1-5
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：50.6KB
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一,、細胞復蘇和接種
1. 37℃預熱大鼠間充質干細胞培養(yǎng)液（RM-001）和基礎培養(yǎng)液（RM-001B）。
2. 從液氮中取出細胞產品管,，快速將其置入37℃水浴中解凍,，直到管中只剩下zui后一片結晶（注意：不要讓水沒過產品管）。
3. 在生物安全柜中,，用75%的酒精擦拭產品管外壁,。
4. 將產品管中的細胞移至15 ml無菌離心管中，慢慢逐滴加入預溫的37℃ 基礎培養(yǎng)液（RM-001B）4-5ml混勻,，邊滴加邊搖勻,。
5. 用1ml基礎培養(yǎng)液（RM-001B）沖洗產品管，并將其轉移到15 ml離心管中,，邊滴加邊搖勻,。
6. 輕輕混勻細胞后，取10 μl細胞懸液和10 μl臺盼藍混勻,，從中取10 μl計數,。 這一步驟非常重要，能確定您收到的產品是否合格（詳見如何計數復蘇的細胞）
7. 細胞懸液在1 000 rpm,，室溫條件下,，離心5分鐘，去除上清,。
8. 加*培養(yǎng)液4-5ml, 調整細胞量,，輕輕混勻細胞，備用,。
9. 按5 000-7 500細胞/cm2接種細胞,。
10. 每個T25培養(yǎng)瓶中加*培養(yǎng)液（RM-001）3-5ml， 后置于37℃,、5%CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng),。
二、細胞換液和培養(yǎng)
注意：復蘇或傳代后的細胞,，請于24小時后,，*次更換培養(yǎng)液
1. 復蘇后的細胞經37℃,、5%CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24小時，此時細胞已*貼壁,，更換培養(yǎng)液后,，請繼續(xù)在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),。
2. 之后,，每2-3天更換培養(yǎng)液1次，至細胞長至覆蓋培養(yǎng)面的 80% 可進行傳代或凍存,。
3. 換液前,，請將培養(yǎng)液從4℃中取出，使其恢復到室溫,。
三,、消化細胞
1. 消化液的配制：pH7.0-7.2 ，分別配制0.5%胰酶液和0.04%EDTA-Na2液,，用前按1：1混合,。將PBS或D-Hank'S液, 消化液，含10% FBS的基礎培養(yǎng)液回復到室溫,。
2. 具體操作如下：
（1）吸去培養(yǎng)液,，加入3 ml PBS或D-Hank'S液，使PBS或D-Hank'S液均勻的分布在培養(yǎng)瓶細胞表面,。1分鐘之后,，吸去PBS或D-Hank'S液。
（2）每個T25培養(yǎng)瓶加入消化液 2 ml,，使消化液均勻的分布在培養(yǎng)瓶細胞面,。
（3）25℃消化2分鐘，在顯微鏡下看細胞回縮成圓形后,，輕輕震動使絕大部細胞脫落,。
（4）向每個培養(yǎng)瓶中加 3-5 ml 含10% FBS的 基礎培養(yǎng)液(RA-001B) 中和胰酶的消化作用。
（5）用吸管輕輕吹打培養(yǎng)面使細胞*脫落后,，吸至15 ml無菌離心管內,。
（6）20℃，1 500 rpm 離心 5分鐘,，棄上清,。
（7）加入一定*培養(yǎng)液（RM-001)，調整細胞數量后,，抽樣加入胎盤藍計數,，得到細胞數和活性后，按細胞數傳代或凍存。
四,、細胞傳代
1. 消化細胞（詳見第三步）,。
2. 按5000-7500個細胞/cm2接種細胞于T25的培養(yǎng)瓶中。
3. 每個培養(yǎng)瓶中加*培養(yǎng)液（RM-001）3-5ml,，后置于37℃,、5%CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
五,、細胞凍存
1. 調整細胞數5×105 /ml,，加入一定量的基礎培養(yǎng)液（RM-001B)。之后,，配制等量的冷凍保護劑,。
2. 冷凍保護劑的配制：FBS占80％，DMSO占20％
3. 將細胞懸液于冰浴中,，慢慢逐滴加入冷凍保護劑,，邊滴加邊搖動，加完后用輕輕吹打混勻,。
4. 在冰浴中，將細胞分裝于凍存管中,，每管1ml或1.8 ml,。
5. 將凍存管置于凍存盒(NALGENE Cat No. 5100-0001)內，放入-80℃冰箱中,，24小時后轉入液氮中保存,。