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細(xì)胞冷凍保存方法,、注意事項
最近更新時間：2014-11-19
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1、欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài),，約為80 – 90 ％致密度,。
2、冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生,。
3、注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì),。DMSO 應(yīng)為試劑級等級,，無菌且無色(以0.22 micron FGLP flon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650),，以5~10 ml 小體積分裝,，4 oC 避光保存，勿作多次解凍,。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級,，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性,。
4、冷凍保存之細(xì)胞濃度：
（1）normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
（2）hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml,，細(xì)胞濃度不要太高,，某些hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。
（3）adherent tumor lines: 5~7 x 106,，依細(xì)胞種類而異,。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml,。
（4）other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml,。
5、冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時,，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗,。
6,、冷凍方法：
（1）傳統(tǒng)方法: 4 oC 10 分鐘---> -20 oC 30 分鐘---> -80 oC 16 - 18 小時(或隔夜)---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。
（2）程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1 ～ -3 oC/分鐘之速度由室溫降至–120 oC,，放在液氮槽vapor phase 長期儲存,。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。
7,、材料：
（1）生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞
（2）新鮮培養(yǎng)基
（3）DMSO (Sigma D-2650)
（4）無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
（5）0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
（6）血球計數(shù)盤與蓋玻片
（7）等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)
8,、步驟：
（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形,。
（2）配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中,，zui后濃度為5-10％，混合均勻,，置于室溫下待用,。
（3）依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞,，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
（4）離心,，去除上清液,，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml,，混合均勻,，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1 ml/vial,，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測,。
（5）冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 oC 10 分鐘→ -20 oC 30 分鐘→ -80 oC 16～18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。
（6）冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中,，再放入液氮槽中,。程序?yàn)? program 7: HB CELL