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外源基因在真核細(xì)胞表達(dá)技術(shù)
最近更新時(shí)間：2014-11-14
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一,、生化方法
1、磷酸鈣介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞
（1）轉(zhuǎn)染前24 h,，通過胰酶消化收集細(xì)胞,，用適當(dāng)?shù)?培養(yǎng)基以1×105至4×105細(xì)胞/cm2的密度平鋪細(xì)胞于60 mm組織培養(yǎng)皿或12孔板上。于含5%～7% CO2的37℃溫箱孵育20～24 h。轉(zhuǎn)染前1 h換液,。
（2）按照下屬方法制備磷酸鈣-DNA沉淀：于5 ml滅菌塑料管內(nèi)混合100μl 2.5 mol/L CaCl2與25μg質(zhì)粒DNA,，如有必要用0.1×TE（pH7.6）將體積補(bǔ)至1 ml。室溫下將以上2×鈣-DNA溶液與等體積的2×HEPES鹽溶液混合,。迅速彈敲試管側(cè)壁混勻溶液,，靜置1 min。
（3）立即將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至上述單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中,。每1 ml培養(yǎng)基加0.1 ml懸液,。輕輕搖動(dòng)平皿混勻培養(yǎng)基，培養(yǎng)基會(huì)變成混濁的橘黃色,。一旦形成DNA沉淀,，轉(zhuǎn)染效率會(huì)大大降低，因此此步動(dòng)作應(yīng)盡可能迅速,。如果是用氯喹,、甘油與/或丁酸鈉處理細(xì)胞，直接進(jìn)行步驟5,。
（4）如果轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不用轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑處理,，則置于含5%~7%CO2的37℃溫箱孵育。2～6 h后,，吸去培養(yǎng)基與DNA沉淀,。加入5 ml 37℃預(yù)熱的*培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回孵箱孵育1～6天,。繼續(xù)步驟6檢測(cè)轉(zhuǎn)染DNA的瞬時(shí)表達(dá),，或者如果是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化則直接進(jìn)行步驟7。
（5）在磷酸鈣-DNA沉淀物的存在下用氯喹處理細(xì)胞或者吸去沉淀溶液后將細(xì)胞暴露于甘油與丁酸鈉中會(huì)促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA,。
2,、用氯喹處理細(xì)胞
氯喹是一種弱堿，推測(cè)是通過抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體水解酶降解DNA而發(fā)揮作用（Luthman and Magnusson 1983）,。細(xì)胞對(duì)氯喹毒性的敏感度限制了培養(yǎng)基中加入氯喹的濃度及時(shí)間,，不同細(xì)胞所需氯喹*濃度根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而定。
（1）在把磷酸鈣-DNA沉淀物加入細(xì)胞前或后按1：1000將100 mmol/L氯喹直接加入培養(yǎng)基中,。
（2）細(xì)胞于含5%~7%CO2的37℃溫箱中孵育3~5 h,。
（3）在用DNA于氯喹孵育細(xì)胞后，移去培養(yǎng)基,，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞,，加5 ml預(yù)熱的*培養(yǎng)基。細(xì)胞于孵箱中培養(yǎng)1～6天,。繼續(xù)步驟6檢測(cè)轉(zhuǎn)染DNA的瞬時(shí)表達(dá),，或者直接進(jìn)行步驟7以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子,。
3、丁酸鈉處理細(xì)胞
丁酸鈉的作用機(jī)制并不確定,；但它是組蛋白乙?；纬墒雇鈦碣|(zhì)粒DNA趨于轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)（Workman and Kingston 1998）。
（1）甘油休克處理后,，將500 mmol/L丁酸鈉直接加入生長培養(yǎng)基（甘油處理的步驟d）,。細(xì)胞類型不同，所用丁酸鈉的濃度也不同,。例如：
CV-1 10 mmol/L
NIH-3T3 7 mmol/L
HeLa 5 mmol/L
CHO 2 mmol/L
其他細(xì)胞系所需濃度依經(jīng)驗(yàn)而定,。