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大鼠心肌細(xì)胞分離
最近更新時間：2014-11-5
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大小：50.6KB
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大鼠心肌細(xì)胞比乳鼠心肌難養(yǎng),，用無血清培養(yǎng)基,，呈桿狀，橫紋清楚,，在培養(yǎng)基里細(xì)胞不搏動,。
大鼠心肌細(xì)胞分離一般是采用二型膠原酶分離，濃度為1mg/ml（用無鈣臺氏液配制）,，同時酶液里加入?；撬幔珺SA,。一般采用Langendorff灌流的方法,，大鼠開胸后，迅速取出心臟,，放入冰的臺氏液中,，找到主動脈后，掛上Langendorff裝置,，衡流泵灌入無鈣臺氏液（37度）,，開始心臟會搏動幾下，這樣把心臟中的淤血擠出（此處也有人用有鈣臺氏液灌流,，好讓心臟充分搏動,，把淤血擠出，不過我們摸索發(fā)現(xiàn)只要取心臟到掛上去的時間短,，一般搏動幾下就能把淤血清楚干凈了）,。幾分鐘后，換酶液開始灌流心臟,，一般開始時,，心臟較軟,，待消化一段時間后變硬，繼續(xù)消化后又變軟,，且心臟發(fā)白,，這時候就可以停止消化，將心室剪下,，放入KB液中,，用剪刀剪碎后，用滴管吹打,，取上清,，繼續(xù)加入KB液，吹打,，直到上清液不渾濁為止,，一般吹打3－4次即可。將各次上清合并,，吹打過濾后,，沉降20分鐘左右，棄上清,，加入無血清培養(yǎng)基（MEM,，不含L－谷氨酰胺，并加入肌酸,，?；撬幔珺SA,，肉毒堿,，HEPES），吹打,，1000轉(zhuǎn)/分離心半分鐘,，棄上清，再洗1－2次后,，將沉淀加入到6％的BSA中沉降15－20分鐘（純化心肌細(xì)胞）,，然后計數(shù)，點(diǎn)板或培養(yǎng),。
此法中如果各步注意無菌操作,，zui后先用加倍雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，再換正常培養(yǎng)基,，可適用于條件不是很好的試驗室,。如果能在板或瓶內(nèi)加入Laminin處理后，貼壁很好。如果分離出來的心肌細(xì)胞,，逐級復(fù)鈣后培養(yǎng),，狀態(tài)更好,。*狀態(tài)此中方法能培養(yǎng)7天以上,。