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單核細(xì)胞分離原理,、方法及要點(diǎn)
最近更新時(shí)間：2014-10-10
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本原理：本文分離單核細(xì)胞所用方法是Percoll非連續(xù)性密度梯度離心法，主要是根據(jù)不同細(xì)胞間密度的差別進(jìn)行細(xì)胞分離,。此法易操作,，且使用通常的實(shí)驗(yàn)設(shè)備即可完成。
試劑與器材
1）外周血單個(gè)核細(xì)胞
2）1×PBS和10×PBS（無(wú)Ca2+,、Mg2+,，0.5mM EDTA），胎牛血清（56℃,，30分鐘加熱滅活）,，HCl 1mol/L,。
Percoll分層液（密度=1.130g/ml,商品），4g/L臺(tái)盼藍(lán)染液（溶解在PBS液中),。
3）50ml聚丙烯圓錐管,，毛細(xì)吸管，移液管（1,、2,、10ml）。
4）CO2孵箱,，超凈臺(tái),，有旋轉(zhuǎn)桶轉(zhuǎn)子裝置的離心機(jī)，PH計(jì),。
操作步驟——所有的操作應(yīng)該在無(wú)菌條件下進(jìn)行
（一）不同密度Percoll分層液的配制
1.Percoll分層液儲(chǔ)備液的制備：取未稀釋的Percoll原液（從瓶中?。?ml+1ml 10×PBS （無(wú)Ca2+、Mg2+）,，用HCl 調(diào)節(jié)PH至7.4
2. Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll儲(chǔ)備液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml 1× PBS1（無(wú)Ca2+,、Mg2+）
3. Percoll分層液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml 1×PBS（ 無(wú)Ca2+、Mg2+）
4. Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分層液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml 1×PBS（無(wú)Ca2+,、Mg2+）
（二）不連續(xù)密度梯度制備
1. 將洗滌過(guò)的8×107外周血單個(gè)核細(xì)胞重新懸浮在2ml的Percoll分層液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在這層液體的表面上輕輕鋪上2ml Percoll分層液（Ⅱ）（密=1.069g/ml）,，后再于第二層液面上輕輕鋪上2ml的Percoll分層液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）
2. 20℃，在旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子中1000×g離心上步所形成的密度梯度90分鐘（慢慢增加速度,，無(wú)制動(dòng)停轉(zhuǎn)）,。
（三）單核細(xì)胞的分離
1. 離心后單核細(xì)胞存在于Percoll分層液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度較小的部分）之間的界面中。
2. 用毛細(xì)吸管仔細(xì)收集單核細(xì)胞,。
3. 用含1-5%胎牛血清的 1×PBS液洗滌細(xì)胞3次,，4℃，400×g離心5分鐘,，棄上清液,。
4. 若需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞重新懸浮于培養(yǎng)基中,。
5. 用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞存活率,。
結(jié)果：本法回收的細(xì)胞中單核細(xì)胞占70-100%（存活率應(yīng)大于90%），淋巴細(xì)胞占0-20%,，粒細(xì)胞占0-5%,，紅細(xì)胞占0-7%，血小板小于0.5%,。
實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)
1.為了得到較好的結(jié)果,，外周血單個(gè)核細(xì)胞分離后應(yīng)立即使用。
2.所有操作過(guò)程應(yīng)在18-20℃中進(jìn)行。
3.仔細(xì)覆蓋各種Percoll分層液,，避免破壞其界面,。
4.洗滌分離細(xì)胞3次，以除去殘存的Percoll分層液和血小板,。
5.如果所制備的細(xì)胞仍不純,，可使用包被有抗CD2、抗CD3,、抗CD19抗體分子的磁珠,， 以除去殘存的NK、T,、B淋巴細(xì)胞,。