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表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性的檢測(cè)
最近更新時(shí)間：2014-9-25
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一,、MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性
（一）原理
活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能催化無(wú)色的MTT形成藍(lán)色的甲肷,，其形成的量與活細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)呈正相關(guān)。對(duì)細(xì)胞活力有影響的表達(dá)蛋白活性檢測(cè)可以通過(guò)MTT比色法進(jìn)行,。
（二）試劑準(zhǔn)備
1,、 青鏈霉素溶液（100X）：青霉素100萬(wàn)U，鏈霉素100萬(wàn)U,，溶于100mlddH2O中, 抽濾除菌,。
2、 L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1000mlL15培養(yǎng)基,，加2g碳酸氫鈉,，10ml 100X青鏈霉素，5mlHEPES,。
3,、 MTT液：5mg/ml溶于L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
4,、 SDS處理液：20gSDS,，50μl二甲基甲酰胺，加雙蒸水50ml溶解,。
5,、 L-多聚賴氨酸：50μg溶于1ml雙蒸水中。
6,、 L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解的不同濃度的蛋白液,。
（三）操作步驟（以背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)為例）
1、 無(wú)菌條件下取新生一天的SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）,。
2,、 鏡下去除神經(jīng)根和外膜，放入1ml 0.1%膠原酶中37℃消化30min,，每5min搖勻一次,。
3、 洗去膠原酶,，吹打分散后,，接種于預(yù)先涂有L-多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，每孔含100μl無(wú)血清L15培養(yǎng)基,，細(xì)胞約800個(gè),。
4、 實(shí)驗(yàn)組分別加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同的蛋白濃度），陰性對(duì)照加入等體積表達(dá)蛋白的溶劑,。
5、 37℃ 5%CO2培養(yǎng)48hr后,，每孔加入10μl MTT,，37℃ 5%CO2孵育4hr。
6,、 加入100μl 20%的SDS處理液,，37℃孵育20hr。
7,、 用EL×800微孔酶標(biāo)儀測(cè)定OD570值,，數(shù)據(jù)分析。
二,、DRG無(wú)血清培養(yǎng)檢測(cè)促神經(jīng)生長(zhǎng)作用
（一） 操作步驟：
1,、無(wú)菌條件下取新生一天的SD大鼠DRG。
2,、鏡下去除神經(jīng)根和外膜,，接種于預(yù)先涂有L-多聚賴氨酸的96孔培養(yǎng)板中，每孔1個(gè)DRG,。
3,、待DRG貼壁后加入100μl無(wú)血清L15基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入純化的表達(dá)蛋白（分別以不同的蛋白濃度）,，陰性對(duì)照加入等體積的溶解表達(dá)蛋白的溶劑,。
4、37℃ 5%CO2培養(yǎng),，每天在Olympus倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,，并進(jìn)行測(cè)量，其數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析,。
三,、注意事項(xiàng)
1、MTT有毒,，注意防護(hù),。
2、單個(gè)DRG貼壁實(shí)驗(yàn)操作難度較大,，需仔細(xì)耐心,。