會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://sorrent.com.cn/st236594/
士鋒生物磷酸鈣細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)
最近更新時(shí)間：2014-9-22
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
文件類型：PNG 圖片下載次數(shù)：437次
資料類型：未知文件瀏覽次數(shù)：743次
實(shí)驗(yàn)原理]
磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復(fù)合物的一種將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法，磷酸鈣被認(rèn)為有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面的結(jié)合,。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過胞飲作用進(jìn)入靶細(xì)胞,，被轉(zhuǎn)染的DNA可以整合到靶細(xì)胞的染色體中從而產(chǎn)生有不同基因型和表型的穩(wěn)定克隆。這種方法首先由Graham和vander Ebb使用,，后由Wigler修改而成,。可廣泛用于轉(zhuǎn)染許多不同類型的細(xì)胞,，不但適用于短暫表達(dá),，也可生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
[儀器,、材料和試劑]
1 呈指數(shù)生長的真核細(xì)胞（如HeLa,BALB/c3T3,NIH3T3,CHO,或鼠胚胎成纖維細(xì)胞）
2 *培養(yǎng)液（依所用的細(xì)胞系而定）
3 CsCl純化的質(zhì)粒DNA （10～50μg/次轉(zhuǎn)染,，二次純化）
4 2×HEPES緩沖鹽水(HeBS)(pH6.95～7.05) 50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH調(diào)pH至6.95～7.05,過濾除菌后,-20℃保存?zhèn)溆谩?/em>
5 2.5mol/L CaCl2過濾除菌,-20℃保存?zhèn)溆谩?/em>
6 磷酸緩沖鹽水（PBS）
7 37℃,，5%CO2的加濕培養(yǎng)箱
8 100mm組織培養(yǎng)平板
9 15ml錐形管
[方法與步驟]
1 傳代細(xì)胞準(zhǔn)備 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24h傳代,待細(xì)胞密度達(dá)50%～60%滿底時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染,。加入沉淀前3～4h,，用9ml*培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。
2 DNA沉淀液的準(zhǔn)備 首先將質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板）,，空氣中晾干沉淀,，將DNA沉淀重懸于μL無菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2,。
3 用巴斯德吸管在500μL 2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液,，同時(shí)用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完,，整個(gè)過程需緩慢進(jìn)行,，至少需持續(xù)1～2min。
4 室溫靜置30min,出現(xiàn)細(xì)小顆粒沉淀,。
5 將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中,，輕輕晃動(dòng)。
6 在標(biāo)準(zhǔn)生長條件下培養(yǎng)細(xì)胞4～16h,。除去培養(yǎng)液,，用5ml 1×HeBS洗細(xì)胞2次，加入10ml*培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,。
7 收集細(xì)胞或分入培養(yǎng)皿中選擇培養(yǎng),。
[注意事項(xiàng)]
1 在整個(gè)轉(zhuǎn)染過程中都應(yīng)無菌操作。
2 為獲得*實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，DNA應(yīng)不含蛋白質(zhì)和酚,。乙醇沉淀后的DNA應(yīng)保持無菌，并在無菌水或Tris EDTA中溶解,。
3 沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要,。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時(shí)需用空氣吹打，以確保形成盡可能細(xì)小的沉淀物,，因?yàn)槌蓤F(tuán)的DNA不能有效地粘附和進(jìn)入細(xì)胞,。
4 在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量,，因?yàn)樯踔疗x*條件十分之一個(gè)pH都可能導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗,。