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士鋒生物如何進(jìn)行細(xì)胞凍存及細(xì)胞復(fù)蘇
最近更新時(shí)間：2014-9-18
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冷凍保存方法
按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來劃分,，凍存方法可分為非玻璃化和玻璃化凍存兩種。非玻璃化凍存是利用各種溫級的冰箱分階段降溫至-700C～-800C,，然后直接投入液氮進(jìn)行保存,；或者是利用電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀以及利用液氮的氣、液,，按一定的降溫速率從室溫降至-1000C以下,，再直接投入液氮保存的方法,。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成,。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法,。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒有冰晶的形成,。但目前細(xì)胞凍存zui常用的仍是前一種方法。
一,、非玻璃化凍存方法
下面以腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞為例,，介紹非玻璃化凍存細(xì)胞的詳細(xì)過程。
主要材料
1. 儀器設(shè)備：普通冰箱,、-300C低溫冰箱和-700C～-800C超低溫冰箱,、液氮凍存罐、高速離心機(jī),、電子計(jì)算機(jī)程控降溫儀等,；
2. 凍存管：容量為1ml或1.5ml,；
3. 冷凍保護(hù)液：一般是以9份小牛血清或細(xì)胞培養(yǎng)液與1份DMSO混合而成。現(xiàn)配現(xiàn)用,，或配制后防入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存,。使用前，于室溫下水浴溶解,；
4. 待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞,。
操作過程
1. 待凍存細(xì)胞懸液的制備
(1)按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液,，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù),；
(2)將細(xì)胞懸液以800～1000r/min離心5min，去上清夜,；
(3)向細(xì)胞沉淀物中加入冷凍保護(hù)液,，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×106～1×107個(gè)/ml,；
(4)按每管1～1.5ml的量分裝于凍存管內(nèi),，擰緊管蓋；
(5)再凍存管上做好標(biāo)記,，包括細(xì)胞代號及凍存日期,。
2. 分級冷凍
(1)先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），約40min,；
(2)接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-100C～-200C）,，約30～60min；
(3)將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱（-300C）,，放置30min左右,；
(4)然后將凍存管轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱（-700C～-800C），,；
(5)zui后將凍存管投入液氮保存,。
3. 記錄
做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期,、細(xì)胞代號,、凍存管數(shù)、凍存過程中降溫的情況,、凍存位置以及操作人員,。
凍存結(jié)果
如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上,。
討論
在使用DMSO前,，不要對其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用,。高壓滅菌反而會破壞其分子結(jié)構(gòu),，以致降低冷凍保護(hù)效果,。在常溫下，DMSO對人體有毒,，故在配制時(shí)帶手套,。
在將細(xì)胞凍存管投入液氮時(shí)，動作要小心,、輕巧,，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出,，可能對皮膚造成凍傷,。操作過程中帶防凍手套、面罩,、工作衣或防凍鞋,。
應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細(xì)胞具有高活力,，還要確保無微生物污染,，這樣的細(xì)胞才具有凍存價(jià)值。另外,，在每批細(xì)胞凍存一段時(shí)間后,，要復(fù)蘇1～2管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染,。
凍存管宜采用塑料凍存管,，不宜使用玻璃安瓿。因?yàn)樵趶?fù)蘇時(shí),，需要從-1960C的液氮中取出凍存管,，立即投入37～400C溫水中，溫差很大,，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險(xiǎn),。
二、玻璃化凍存方法
以下以人單核細(xì)胞為例說明這種細(xì)胞凍存方法（Takhashi et al. 1986）,。
主要材料
1. 冷凍保護(hù)液：為Hanks平衡鹽溶液加入20.5%DMSO（w/v）,、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成,。用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用,。
2. 凍存管：SILASTIC玻璃小管,，內(nèi)徑3mm，外徑4.5mm,；
3. 設(shè)備：液氮儲存罐,；
4. 待凍存細(xì)胞：人類外周血單核細(xì)胞,。
凍存過程
1. 用常規(guī)方法分離全血中單核細(xì)胞；
2. 在冰浴中預(yù)冷冷凍保護(hù)液,；
3. 將裝有單核細(xì)胞的離心管放置入盛有冰水的燒杯內(nèi)（冰?。?/span>
4. 沿離心管壁緩慢滴加預(yù)冷的冷凍保護(hù)液,。滴加過程為：前3min以0.3ml/min速度滴加,，后5min以0.6ml/min速度滴加，余下的凍存液以0.75ml/min速度滴加,。2×107個(gè)細(xì)胞要滴加15ml凍存液,。滴加的時(shí)間在15min左右。zui終細(xì)胞密度要在1×106～1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml,，邊滴加邊輕輕晃動離心管,；
5. 輕輕吹吸混勻細(xì)胞冷凍懸液；
6. 將細(xì)胞冷凍懸液分裝于凍存管中,。12cm長的凍存管裝0.8ml細(xì)胞冷凍懸液,；
7. 將凍存管兩端以火焰封口；
8. zui后將凍存管直接投入液氮中保存,。降溫速度約為6000C/min,。
凍存結(jié)果
如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上,。
討論
玻璃化凍存法對細(xì)胞活性的保存具有較好的效果,，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有液氮儲存設(shè)備即可使用,。目前,，該方法已在胚胎冷凍方面得到廣泛應(yīng)用，但很少應(yīng)用于一般細(xì)胞的凍存,。這可能與需要配制較復(fù)雜的凍存液以及冷凍前和復(fù)蘇后較煩瑣的操作有關(guān),。
因?yàn)椴ＡЩ鋬霰Ｗo(hù)液中的冷凍保護(hù)劑的濃度較高，室溫下對細(xì)胞具有毒性（但在40C時(shí)毒性大為減弱）,。所以,，冷凍保護(hù)液的滴加全過程必須在40C冰浴中進(jìn)行。另外,，滴加速度要緩慢,，如果滴加速度過快，則在細(xì)胞外產(chǎn)生很高的滲透壓,，造成細(xì)胞膜的損傷,，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故要緩慢滴加，讓冷凍保護(hù)劑有足夠的時(shí)間緩慢滲透到細(xì)胞內(nèi),，達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外的平衡,。
凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
一、非玻璃化凍存的復(fù)蘇方法
主要材料
1. 儀器設(shè)備：恒溫水浴箱,、高速離心機(jī),；
2. 培養(yǎng)用液：*培養(yǎng)液。
復(fù)蘇過程
1. 調(diào)配370C～400C的溫水,，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至370C～400C,；
2. 從液氮中取出凍存管，立即投入370C～400C 溫水中迅速晃動,，直至凍存液*溶解,；
3. 將細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液,，輕輕吹打混勻,；
4. 將細(xì)胞懸液經(jīng)800～1000r/min離心5min，棄上清夜,；
5. 向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入*培養(yǎng)液,，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi),，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),。
結(jié)果
復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保持其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上,。
討論
細(xì)胞凍存懸液一旦融解后,，要盡快離心除去冷凍保護(hù)液，防止冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞產(chǎn)生毒性,。實(shí)驗(yàn)人員在復(fù)蘇細(xì)胞過程中,，同樣應(yīng)具有自我保護(hù)意識，避免被液氮凍傷,。
二,、玻璃化凍存的復(fù)蘇方法
以下以人的單核細(xì)胞為例說明其過程（Takhashi et al. 1986）。
主要材料
1. 設(shè)備：高速離心機(jī),；
2. 培養(yǎng)用液：添加20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液,、培養(yǎng)液。
操作過程
1. 將凍存管從液氮中取出,，立即投入冰浴中5min,。復(fù)溫速率約5600C/min。一次可以進(jìn)行多個(gè)凍存管的復(fù)蘇,；
2. 將凍存管兩端剪斷,，可以將5ml細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中,；
3. 沿離心管壁緩慢加入已在冰浴中預(yù)冷的含20%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液,。前10min以0.2ml/min的速度加入,，后10min 以0.5ml/min的速度加入，接著的15min以0.75ml/min的速度加入,，zui后30min以1ml/min的速度加入,。全過程約為65min，都在冰浴中進(jìn)行,；
4. 將稀釋后的細(xì)胞懸液以400r/min離心5min,，去除上清。向細(xì)胞沉淀中加入培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,，用于培養(yǎng),。
結(jié)果
復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保存其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上,。