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細胞生長檢測:染料染色法測定細胞數(shù)
最近更新時間：2014-9-10
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
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1）結(jié)晶紫檢測法
1．在96孔細胞培養(yǎng)板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164細胞的培養(yǎng)液（含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液）,，37℃ 5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3小時，讓細胞帖壁,。
2．用RPMI-1640培養(yǎng)液10倍遞次稀釋TNF標準品,，根據(jù)需要3～5倍遞次稀釋待檢樣品,，每孔加0.1ml稀釋的標準品或待檢樣品，每個稀釋度3個重復(fù)孔,。對照孔6個,，3個陽性對照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培養(yǎng)液，3個陰性對照孔各加100μl RPMI-1640培養(yǎng)液,。繼續(xù)培養(yǎng)18～24小時,。
3．甩去培養(yǎng)液，用PBS小心洗滌一次,，每孔加0.1ml 10％甲醇溶液固定細胞30秒鐘,。
4．吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml結(jié)晶紫染液,，室溫中放置20分鐘,。
5．輕輕甩去染色液，用蒸餾水洗滌各孔,，將培養(yǎng)板倒置于吸水紙上吸干水分,。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室溫中長期保存,。
6．測定前,，每孔加0.1ml 33％醋酸脫色，充分振蕩后在570nm處測定光吸收度,。用光吸收度（OD）值對樣品稀釋度作圖,，比較標準品曲線和待檢樣品曲線即可得到待測樣品中的細胞因子活性
2）NBB檢測法
1．在用細胞因子處理靶細胞以后傾去培養(yǎng)液，倒置培養(yǎng)板于吸水紙上吸干培養(yǎng)液,。再用100μl磷酸緩沖鹽水小心洗去死細胞,，用吸水紙吸干培養(yǎng)液。
2．每孔加100μl NBB染液,，室溫中染色30分鐘,。輕輕染液。用吸水紙吸干染液,。
3．每孔加100μl福爾馬林固定液固定15分鐘,。用自來水輕輕洗去固定液，倒置培養(yǎng)板,，用吸水紙吸干染液,。