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時間分辯熒光分析法
最近更新時間：2014-9-2
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
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1）銪熒光檢測法
標(biāo)記靶細胞
1．EuCl3的制備：稱取58.08mg Eu2O3，用少量1N HCl攪拌至溶解,，再用1N NaOH調(diào)節(jié)pH至4.0,。加雙蒸水配成33～100mmol/L的保存液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2．用預(yù)冷的標(biāo)記液將靶細胞濃度調(diào)整到5×106/ml,，加50μl 10mg/ml硫酸葡聚糖,，置冰浴中20分鐘，其間搖晃數(shù)次,。
3．加入30μl 100mmol/L CaCl2溶液終止反應(yīng)5分鐘,。
4．用含2mmol/L CaCl2的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細胞5次,。用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將靶細胞配成5×104/ml。
檢測方法
1．在96孔圓底細胞培養(yǎng)板中加入靶細胞懸液,，每孔加100μl,。
2．向各孔加100μl效應(yīng)細胞，效應(yīng)細胞與靶細胞的比例根據(jù)要求而定,，通常為5：1～20：1,。自然釋放孔不加效應(yīng)細胞只加100μl培養(yǎng)液，zui大釋放孔中加100μl 0.5％ Triton X-100,。每個實驗置三個復(fù)孔,。
3．置37℃ 5％ CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時。
4．從每孔吸出20μl上清液,，對應(yīng)加入另一塊96孔酶標(biāo)板中,，向第二塊板每孔加200μl增強液。室溫中混合5分鐘,。在時間分辯熒光分析儀上測定各孔的熒光強度,。同時做EuCl3的標(biāo)準(zhǔn)曲線：用0.05mol/L pH7.0檸檬酸緩沖液配制10倍梯度
5．特異性殺傷活性計算：殺傷活性（％）＝