會(huì)員.png)
QQ交談
您所在位置：請(qǐng)輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機(jī)：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個(gè)性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://sorrent.com.cn/st236594/
制備率感受態(tài)注意事項(xiàng)
最近更新時(shí)間：2014-8-25
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>50.6KB
文件類型：PNG 圖片下載次數(shù)：124次
資料類型：未知文件瀏覽次數(shù)：672次
液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上劃線,37度至長出單菌落.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個(gè), 接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基. 培養(yǎng)基量不可再多,會(huì)影響效率.在18度 150-250RPM 培養(yǎng)19-50小時(shí)*沒有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高于37度.OD600約0.4-0.8時(shí)停止培養(yǎng), 放在冰水中冷卻10分鐘4度, 300RPM離心15分鐘, 回收菌體去掉上清后, 用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮, 在冷10分鐘再次離心回收菌體用1/12.5體積的TB懸浮, 添加zui終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘0.1-1毫升分裝, 直接在液氮中凍上.在液氮或-80度保存.
TB溶液*TRANSFORMATION BUFFER
PIPES 3.0G 10mM
CaCl2.2H2O 2.2g 15mM
KCl 18.6g 250mM
add water up to 950ml
用 5N KOH 調(diào)PH至6.7-6.8*低PH不溶
在加終濃度未55mM的MnCl2.4H2O 10.9g
定溶到1升, 過濾滅菌, 4度保存.
但有人提出, 凍存后轉(zhuǎn)化效率降低, 且這種方法不適合大質(zhì)粒.
【zihudie】
（1）將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37℃培養(yǎng)活化,。
（2）挑取經(jīng)活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養(yǎng)基,，18℃，200-250rpm培養(yǎng),。
（3）當(dāng)OD600=0.5-0.8時(shí),，用預(yù)冷的40mL離心管于4℃，8000rpm離心10min，收集菌體,。
（4）用預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體,，4℃，8000rpm離心10min,，收集菌體,。
（5）重復(fù)第4步操作。
（6）用8mL預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體,，緩慢加入DMSO至終濃度7% ,。
（7）冰浴10min后，分裝保存于液氮中,。
本法效率*,建議大家采納
【yog】
1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM------1%轉(zhuǎn)接-------37度 200RPM2小時(shí)(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 棄上清, 懸浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重懸浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
建議用TSS法,，簡單方便，比氯化鈣法的轉(zhuǎn)化效率高.別的菌可能不一定適用,。
以下為轉(zhuǎn)貼,，具體方法請(qǐng)查閱文獻(xiàn)。
E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備方法:
單菌落平板至2ml LB, 37 oC 250 r/m ovn, 1ml 轉(zhuǎn)至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600
=0.2-0.4
離心后用10毫升TSS重懸后,分裝 -70oC保存,。盡量冰上操作.
轉(zhuǎn)化: 加質(zhì)粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分鐘,，42oC 90秒，冰上2分鐘,，加LB至1ml
, 37oC 1小時(shí)后鋪抗生素平板,。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
0.3ml ddH2O