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重組DNA的轉(zhuǎn)化和藍(lán)白篩選
點(diǎn)擊次數(shù)：1965 發(fā)布時間：2016-7-15
體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能進(jìn)行大量復(fù)制,，增殖和表達(dá),，其首要目的是獲得大量的克隆基因。雖然PCR技術(shù),，體外轉(zhuǎn)錄及翻譯系統(tǒng)能部分達(dá)到大量擴(kuò)增的目的,，但畢竟受到體外操作的許多限制。重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞zui常用的方法之一就是轉(zhuǎn)化(transformation),。轉(zhuǎn)化這一概念來源于遺傳學(xué)：細(xì)菌細(xì)胞的生物學(xué)由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變叫轉(zhuǎn)化,。很多細(xì)菌如桿菌，鏈霉菌屬能自然發(fā)生轉(zhuǎn)化，其它菌屬包括大腸桿菌自然狀態(tài)下無法發(fā)生轉(zhuǎn)化,，但可以通過人工誘導(dǎo)使其處在易于接受外源DNA分子的狀態(tài)即感受態(tài)(competence),，從而使轉(zhuǎn)化得以率地進(jìn)行。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化簡便易行,，它在分子克隆中占據(jù)極為重要的地位,。重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過化學(xué)方法，人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入一個敏感的感受態(tài),，以便外源DNA進(jìn)入細(xì)菌內(nèi),，這項(xiàng)技術(shù)始于Mandel 和Higa 1970年的觀察，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌經(jīng)過冰冷的CaCl2 溶液處理短暫熱休克后,，容易被噬菌體感染,，隨后Cohn 于1972年進(jìn)一步證明質(zhì)粒DNA用同樣的方法也能進(jìn)入細(xì)菌。其原理是細(xì)菌處于0℃,，CaCl2低滲溶液中,，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase 的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘付于細(xì)胞表面,，經(jīng)42℃短時間的熱激處理,，促進(jìn)細(xì)胞吸收復(fù)合物。在富裕培養(yǎng)基中生長一小時后,，質(zhì)?？截悢?shù)增加，抗性基因得以表達(dá),，球形的感受態(tài)細(xì)胞得以復(fù)原,。zui后通過含抗生素的抗性平板篩選轉(zhuǎn)化菌落,。
Ca 2 處理的感受態(tài)細(xì)胞,，一般轉(zhuǎn)化率為105-106/ug DNA。環(huán)化重組質(zhì)粒愈小,，轉(zhuǎn)化率愈高,，環(huán)狀DNA分子比線狀DNA分子的轉(zhuǎn)化率高。在Ca2 的基礎(chǔ)上,，聯(lián)合其他金屬離子( 如 Mn2 ,、Co2 )，DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌,，使轉(zhuǎn)化率提高數(shù)百倍,。
除化學(xué)法轉(zhuǎn)化細(xì)菌外，還有電擊轉(zhuǎn)化法,，電擊法不需要預(yù)先誘導(dǎo)細(xì)菌的感受態(tài),，依靠短暫的電擊，促使DNA進(jìn)入細(xì)菌,，轉(zhuǎn)化率zui高達(dá)到109-10/ug DNA,，因操作簡便愈來愈為人們所接受,。
基因克隆的zui后一道工序就是從眾多的轉(zhuǎn)化菌中篩選出目的陽性克隆并鑒定重組子的正確性。通過細(xì)菌培養(yǎng)以及重組子的擴(kuò)增,，從而獲得目的基因的大量拷貝,，進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能或表達(dá)產(chǎn)物,。從大量的菌落或噬菌斑中鑒定出重組子有許多方法,，如插入失活法、抗性篩選,、藍(lán)白篩選,、雜交篩選、免疫學(xué)篩選,、酶切圖譜鑒定,、PCR鑒定等。而藍(lán)白篩選常用在重組子和非重組子的初步篩選中,，它是通過載體和宿主菌之間基因內(nèi)互補(bǔ)來實(shí)現(xiàn),。許多載體(如pUC,pBS等)都是帶有包括乳糖操縱子的調(diào)控序列和編碼β-半乳糖苷酶前146個氨基酸的基因序列。并在編碼區(qū)中構(gòu)建了多克隆位點(diǎn),，它不破壞讀框,，可使幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶基因的氨基端，而不影響功能,。若有外源基因插入多克隆位點(diǎn)則破壞編碼讀框產(chǎn)生沒活性的α肽段,。宿主菌為缺失產(chǎn)生α肽段的突變體，但能產(chǎn)生其余肽段,。兩者之間進(jìn)行基因內(nèi)互補(bǔ)就產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶基因,。β-半乳糖苷酶基因在IPTG的誘導(dǎo)下產(chǎn)生肽段與宿主菌其余肽段結(jié)合成有活性的β-半乳糖苷酶 。此酶能使顯色底物X-gal分解成藍(lán)色化合物,，從而使菌落發(fā)藍(lán),。若有外源片段插入載體的多克隆位點(diǎn)，則使β-半乳糖苷酶基因失活,，不能產(chǎn)生α肽,，形成白色菌落。利用此方法僅通過目測就輕而一舉地篩選出重組菌落,。
一,、材料，試劑和儀器
1 材料: 受體菌DH5α ,，含lacZ`的重組質(zhì)粒,。
2 試劑:
1)LB固體培養(yǎng)基
2)LB液體培養(yǎng)基
4)0.1mol/L CaCl2
5)抗生素母液
6) 0.5mol/L IPTG
7) 100mg/mL X-gal
表2 常用抗菌素的作用方式及其抗性機(jī)理
3儀器: 恒溫?fù)u床， 冰凍離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱,，
CaCl2轉(zhuǎn)化法
(1) 劃線復(fù)壯宿主菌37℃,。挑一單菌落于30mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃,，200rpm搖至OD600=0.2-0.4,，取出置于冰上10-15min。
(2) 取1mL菌液于滅菌的1.5mL離心管中,。4℃,5000rpm離心5min回收細(xì)胞,。棄上清，吸干殘存培養(yǎng)基,，加500μl冰預(yù)冷的0.1M CaCl2,重懸菌體,，置冰浴15-30min。
4℃,5000rpm離心5min回收細(xì)胞,。棄上清,，吸干水，加100μl冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體,。放置于4℃用于轉(zhuǎn)化,，若不用則加30%甘油置-70℃?zhèn)浯妗?/p>
(3) 加入10μl連接產(chǎn)物到100ul感受態(tài)細(xì)胞中，輕旋以混和內(nèi)含物,，置于冰上30min,。
(4) 42℃熱休克90sec，不要搖動試管,。置冰上1-2min,。
(5) 加400ul 液體培養(yǎng)基，37℃150rpm搖培45-60min,。
(6) 微波爐融化LB固體培養(yǎng)基,，待冷卻至50℃左右時，根據(jù)載體的抗性加入相應(yīng)的抗生素,，如Km 母液至終濃度50ug/mL或Amp母液至終濃度60ug/mL ,，搖勻,。趁熱倒平板,，每板20mL左右，室溫下凝固10-15min,。
(7) 取適量菌液(體積別超過200 ul,，如果想多涂菌可以先室溫下5000rpm離心5min回收細(xì)胞，棄去一部分培養(yǎng)基后,，重懸細(xì)菌后再涂),，加入5ul IPTG(0.5M) 和30ul X-gal (100mg/mL) ，混勻，加到抗性平板上,，用燒過滅菌的涂布器涂布器涂勻,，涂布器應(yīng)涼下來用，否則容易燙死細(xì)菌,。
(8) 培養(yǎng)皿用石蠟?zāi)し夂煤螅?7℃倒置培養(yǎng),。待出現(xiàn)藍(lán)色時取出放在4℃冰箱中，使其顏色更加明顯,。
注意: 1 )質(zhì)粒DNA要純 2 )受體細(xì)菌的OD600nm=0.3-0.4 3) 重組質(zhì)粒的體積小于轉(zhuǎn)化菌液體積的1/10,。
三、結(jié)果與分析
若抗性平板上出現(xiàn)白色菌落,，說明連接的重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化,。根據(jù)藍(lán)白的比例可以判斷重組率，根據(jù)菌落數(shù)目可以計(jì)算出轉(zhuǎn)化率,。一般來說采用定向連接的重組質(zhì)粒的重組率較高,，而平末端或單一酶切位點(diǎn)連接的重組率較低。
轉(zhuǎn)化是一定設(shè)不加質(zhì)粒只含感受態(tài)宿主菌的負(fù)對照和加入已知抗性的質(zhì)粒的正對照,，以便分析結(jié)果,。如果負(fù)對照長出菌落說明感受態(tài)宿主菌具有抗性或抗生素失活，而正對照沒出來,，說明感受態(tài)細(xì)胞有問題或加錯抗生素或操作過程中造成細(xì)菌死亡(如涂布時燙死),。