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受體菌感受態(tài)細胞的制備方法
點擊次數(shù)：1467 發(fā)布時間：2016-7-4
目的與原理
當(dāng)細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)時，即為感受態(tài),，而用理化手段使細菌處于感受態(tài)的操作為致敏過程,。感受態(tài)細胞制備是重組基因能否實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一個重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本試驗是通過鈣離子來誘導(dǎo)使之成為感受態(tài)細胞,。
二,、材料和方法
1. 材料：大腸桿菌
2. 儀器：
離心機，恒溫搖床,，恒溫水浴,，超凈工作臺，冰柜
3. 試劑
lb培養(yǎng)基,，0.1M MgCl2,，3mM氯化六氮合高鈷
TFB：10Mm MES(pH6.3)
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作步驟
大腸桿菌在LB培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)12-16小時,，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)大腸桿菌到對數(shù)期,。取1ml培養(yǎng)物7000rpm，離心3min,，收集菌體,。再重復(fù)一次。冰浴放置,。用預(yù)冷的氯化鎂懸浮菌體7000rpm離心3min,。收集菌體，冰浴放置,。用預(yù)冷的氯化鈣懸浮菌體,，冰浴15min, 7000rpm離心3min,。收集菌體，冰浴放置,。加入200μl預(yù)冷的氯化鈣(或TFB),，放置于冰浴，即得感受態(tài)細胞,，此細胞可現(xiàn)用,，也可進行下步操作。將懸液分裝于無菌離心管中,，投入液氮,，然后儲于-70℃保存。
四,、結(jié)果 (略)
五,、注意事項
一般地，新制備的感受態(tài)細胞48h后轉(zhuǎn)化效率降低,，15d后失效,。因此，感受態(tài)細胞不能保存太久,，4℃保存一周，但-80℃可保存1年,。用試管分裝可避免反復(fù)凍熔,，損傷感受態(tài)細胞。