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真核生物的mRNA分子是單順反子,，是編碼蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,。真核生物的所有蛋白質(zhì)歸根到底都是mRNA的翻譯產(chǎn)物,，因此，高質(zhì)量mRNA的分離純化是克隆基因,、提高cdna文庫構(gòu)建效率的決定性因素,。哺乳動物平均每個細(xì)胞含有約1x10-5?g RNA，理論上認(rèn)為每克細(xì)胞可分離出5～10mg RNA,。其中 rRNA為75％～ 85％,，tRNA占10％～16％,，而mRNA僅占1%～5％,，并且mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一,，表達(dá)豐度也不一樣,。
真核生物mRNA有特征性的結(jié)構(gòu)，即具有5’端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的3’端存在20~300個腺苷酸組成的poly（A）尾,，通常用poly（A+）表示,，這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA分子的提取、純化,，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志,，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。
一般mRNA分離純化的原理就是根據(jù)mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)特性設(shè)計(jì)的,。當(dāng)總RNA流經(jīng)寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時,，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上,，在低鹽濃度或蒸餾水中,，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱,，即可得到較純的mRNA,。
目前常用的mRNA的純化方法有：
（1）寡聚（dT）－纖維素柱層析法，即分離mRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法,；
（2）寡聚（dT）－纖維素液相離心法,，即用寡聚（dT）－纖維素直接加入到總的 RNA溶液中并使mRNA與寡聚（dT）－纖維素結(jié)合，離心收集寡聚（dT）－纖維素／mRNA復(fù)合物,，再用洗脫液分離mRNA,，然后離心除去寡聚（dT）－纖維素；
（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等,。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方法（1）進(jìn)行mRNA的分離純化,。

【試劑與器材】
（一）試劑
1． 0.1mol/L NaOH ，每組200mL
2． 寡聚Oligo（dT）-纖維素
3． 加樣/洗滌緩沖液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),，每組250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS,。
4． 洗滌緩沖液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。
配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6),、NaCl,、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量,，經(jīng)混合后再高壓消毒,，冷卻至65℃時，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SDS至終濃度,。
5． 5 mol/L NaCl,，每組10mL
6． 3 mol/L NaAc pH5.2，每組10mL
7． 無RNase雙蒸水(DEPC水),，每組100mL
8． 70%乙醇,，每組10mL

注意：溶液5，6的配制都應(yīng)該加0.1% DEPC處理,，溶液1,，3，4,，8則用經(jīng)0.1% DEPC處理過的無RNase雙蒸水配制,，Tris應(yīng)選用無RNase的級別。溶液配制后,，能夠按一次實(shí)驗(yàn)所需的分量分裝成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存,，每次實(shí)驗(yàn)只用一份，避免多次操作造成對溶液的污染,。

（二）器材
1． 恒溫水浴箱
2． 冷凍高速離心機(jī)
3． 紫外分光光度計(jì)
4． 巴斯德吸管
5． 玻璃棉
6． 5ml一次性注射器

【操作方法】
（一） oligo(dT)纖維素的預(yù)處理
1． 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素,。
2． 將懸浮液裝入填有經(jīng)DEPC水處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0mL,，用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素,。
3． 用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小于8.0,。
4． 將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出,，用適當(dāng)?shù)闹蚕礈炀彌_液I懸浮，濃度約為0.1g/mL,，保存在4℃待用,。

（二） 總RNA濃度的調(diào)整
1． 把實(shí)驗(yàn)一所提的總RNA轉(zhuǎn)到適合的離心管中，如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL,，則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL,，總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65℃水浴加熱5 分鐘，然后迅速插在冰上冷卻,。
2． 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調(diào)至0.5 mol/L,。

（三） mRNA的分離
1． mRNA與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，按下表取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中,，蓋上蓋子,，顛倒數(shù)次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。于37℃水浴保溫并溫和搖蕩15分鐘,。

總RNA (mg)寡聚Oligo(dT)-纖維素(mL)洗滌緩沖液1,，2 (mL)洗脫體積(mL)<0.20.21.01.00.2-0.50.51.51.50.5-1.01.03.03.01.0-2.02.05.05.0
2． 轉(zhuǎn)移：取1個5ml的一次性注射器，取適量經(jīng)過高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端,，并把它固定在無RNase的支架上,，再把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液轉(zhuǎn)移到注射器，推進(jìn)塞子直至底部,，把含有未結(jié)合上的RNA液體排到無RNase的離心管中（保留至確定獲得足夠的mRNA）,。
3． 洗滌：根據(jù)上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩沖液1,，溫和振蕩,，充分重新懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進(jìn)塞子,，用無RNase的離心管收集洗出液,。測定每一管的OD260，當(dāng)洗出液中OD為0時準(zhǔn)備洗脫,。
4． 洗脫：根據(jù)上表直接用注射器慢慢吸取適量（2-3倍柱床體積）的洗脫緩沖液2或無RNase雙蒸水到注射器內(nèi)充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素,，推進(jìn)塞子以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。
5． 測定每一管的OD260,，合并含有RNA的洗脫液組分于4℃,，2500g，離心2-3分鐘,，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中,，去掉殘余的oligo(dT)-纖維素。
6． 沉淀：洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇,，混勻后,，-20℃30分鐘或放置

。
7． 離心收集：12000g, 4℃離心15分鐘,，小心棄去上清,，mRNA沉淀此時往往看不見，用70%乙醇漂洗沉淀,，12000g, 4℃離心5 分鐘,，小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘,，或真空干燥10分鐘,。將mRNA沉淀溶于適當(dāng)體積的無RNase的雙蒸水,，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。
8． 定量：測定OD260和OD280,，計(jì)算產(chǎn)率以及OD260/OD280的比率（同上一實(shí)驗(yàn)）,。

【注意事項(xiàng)與提示】
1． 整個操作過程必須嚴(yán)格遵守?zé)oRNase操作環(huán)境規(guī)則。
2． 提取的總RNA必須完整,，不能被降解,，這是mRNA質(zhì)量的先決條件。
3． 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當(dāng),，過量的總RNA,，容易造成mRNA不純。
4． RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合前必須置于65℃加熱5 分鐘,，這一步很重要,，其作用（1）破壞mRNA的二級結(jié)構(gòu)，特別是poly(A+)尾處的二級結(jié)構(gòu),，使poly(A+)尾充分暴露,，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結(jié)合,。加熱后應(yīng)立即插入冰上,，以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復(fù)其二級結(jié)構(gòu)。
5． 應(yīng)注意mRNA不能被DNA污染,，即使是1 ppm DNA污染,，也可嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6． mRNA制備后,，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染,。提取的mRNA應(yīng)該在0.5~8.0kb之間呈現(xiàn)彌散狀，無明顯區(qū)帶,，但大部分的mRNA應(yīng)在1-2.0kb范圍內(nèi)（如下圖）,。一般來說，經(jīng)過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留,，但一般來說不會對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成很大的影響,，如果樣品充足，可將經(jīng)過一次純化分離的mRNA再純化一次,，進(jìn)一步提高其純度,。

三   mRNA的分離純化
圖3.1 mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳示意圖
Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;
Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA;
Lane 3, 老鼠肝臟mRNA

7． 為防止mRNA降解，應(yīng)避免多次凍融,，可將mRNA少量分裝后保存,。另外，如果有低溫冰箱,在 -70℃～ -80℃保存。 也可將mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上,。
8． 寡聚(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈,，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存,，重復(fù)使用,。每次用前需用NaOH、滅菌 ddH2O,、層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床,。
9． 一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,，約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%,。

【實(shí)驗(yàn)安排】
1． *天：試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase處理（0.1%DEPC浸泡或高溫干烤）。
2． 第二天：進(jìn)行（一）,、（二）和（三）1-6,。
3． 第三天：進(jìn)行（三）7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測mRNA。
4． 為了避免由于保存時間過長造成的RNA降解,，能將總RNA提取,、、RT-PCR和cDNA文庫構(gòu)建實(shí)驗(yàn)安排在連續(xù)的時間內(nèi)進(jìn)行,。