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植物DNA的提取與測定
點擊次數(shù)：1457 發(fā)布時間：2016-5-23
一,、目的
隨著基因工程等分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展及廣泛應(yīng)用,，人們經(jīng)常需要提取高分子量的植物DNA，用于構(gòu)建基因文庫,、基因組 southern 分析,、酶切及克隆等，這是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的重要步驟,。本實驗?zāi)康氖菍W(xué)習(xí)從植物材料中提取和測定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法,，進一步了解DNA 的性質(zhì)。
二,、原理
細胞中的DNA 絕大多數(shù)以DNA-蛋白復(fù)合物（DNP）的形式存在于細胞核內(nèi),。提取DNA 時，一般先破碎細胞釋放出DNP,，再用含少量異戊醇的氯仿除去蛋白質(zhì),，zui后用乙醇把DNA 從抽提液中沉淀出來。DNP 與核糖核蛋白（RNP）在不同濃度的電解質(zhì)溶液中溶解度差別很大,，利用這一特性可將二者分離,。以NaCl 溶液為例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度僅為純水中的1％,。當NaCl 濃度逐漸增大時,，RNP的溶解度變化不大，而DNP 的溶解則隨之不斷增加,。當NaCl 濃度大于1mol/L 時,，DNP的溶解度zui大，為純水中溶解度的2 倍,，因此通?？捎?.4mol/L NaCl 提取DNA。為了得到純的DNA 制品，可用適量的RNase 處理提取液,，以降解DNA 中攙雜的RNA,。
關(guān)于植物總DNA 的提取主要有兩種方法：
1． CTAB 法：
CTAB（十六烷基*基溴化銨，hexadecyltrimethylammonium bromide, 簡稱CTAB）：
是一種陽離子去污劑,，可溶解細胞膜,，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的,，當降低溶液鹽的濃度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）時從溶液中沉淀,，通過離心就可將CTAB 與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開,，然后將CTAB 與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中,，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中,。
2． SDS 法：
利用高濃度的陰離子去垢劑SDS（十二烷基磺酸鈉,，Sodium dodecyl sulfate, 簡稱SDS）使DNA 與蛋白質(zhì)分離，在高溫（55～65℃）條件下裂解細胞,，使染色體離析,，蛋白變性，釋放出核酸,，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀,，離心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA,。一般生物體的基因組DNA 為107~109bp，在基因克隆工作中,，通常要求制備的大分子DNA 的分子量為克隆片段長度的4 倍以上,，否則會由于制備過程中隨機斷裂的末端多為平末端，導(dǎo)致酶切后有效末端太少,，可用于克隆的比例太低,，嚴重影響克隆工作。因此有效制備大分子DNA 的方法必須考慮兩個原則：（1）盡量去除蛋白質(zhì),、RNA,、次生代謝物質(zhì)（如多酚、類黃酮等）,、多糖等雜質(zhì),，并防止和抑制內(nèi)源DNase 對DNA 的降解。（2）盡量減少對溶液中DNA 的機械剪切破壞,。
幾乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+為輔因子,，故實現(xiàn)（1）盡量去除蛋白質(zhì)的要求,，需加入一定濃度的螯合劑，如EDTA,、檸檬酸,，而且整個提取過程應(yīng)在較低溫度下進行（一般利用液氮或冰浴）,。為實現(xiàn)（2）需要在DNA 處于溶解狀態(tài)時,，盡量減弱溶液的渦旋，而且動作要輕柔,，在進行DNA 溶液轉(zhuǎn)移時用大口（或剪口）吸管,。提取的DNA 是否為純凈、雙鏈,、高分子的化合物,，一般要通過紫外吸收、化學(xué)測定,、“熔點”（melting temperature, Tm）測定,、電鏡觀察及電泳分離等方法鑒定。本實驗采用CTAB 法提取DNA 并通過紫外吸收法鑒定,。
三,、實驗材料、主要儀器和試劑
1．實驗材料
新鮮菠菜幼嫩組織,、花椰菜花冠或小麥黃化苗等
2．主要儀器
（1）高速冷凍離心機
（2）751 型分光光度計
（3）恒溫水浴
（3）液氮或冰浴設(shè)備
（4）磨口錐形瓶
（5）核酸電泳設(shè)備
3．試劑（CTAB 法）
（1）CTAB 提取緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2,，1.4mol/LNaCl（如表1）,，2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巰基乙醇,。
表1 CTAB提取緩沖液配制
植物DNA的提取與測定
用HCl 調(diào)pH 值,。
（2）TE 緩沖液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。