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DNA測序原理和方法
點(diǎn)擊次數(shù)：1770 發(fā)布時(shí)間：2016-5-16
DNA序列測定分手工測序和自動(dòng)測序,，手工測序包括Sanger雙脫氧鏈終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。自動(dòng)化測序?qū)嶋H上已成為當(dāng)今DNA序列分析的主流,。美國PE ABI公司已生產(chǎn)出373型,、377型、310型,、3700和3100型等dna測序儀,，其中310型是臨床檢測實(shí)驗(yàn)室中使用zui多的一種型號(hào)。本實(shí)驗(yàn)介紹的是ABI PRISM 310型DNA測序儀的測序原理和操作規(guī)程,。
【原理】 ABI PRISM 310型基因分析儀(即DNA測序儀),，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法),，因此通過單引物PCR測序反應(yīng),，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3"末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳,，從而避免了泳道間遷移率差異的影響,，大大提高了測序的度。由于分子大小不同,，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同,，當(dāng)其通過毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)檢測器就可對(duì)熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測,，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光,，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像,，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列,，從而達(dá)到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出,。
它是一臺(tái)能自動(dòng)灌膠,、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析等全自動(dòng)電腦控制的測定dna片段的堿基順序或大小和定量的精密儀器,。PE公司還提供凝膠高分子聚合物,，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆?？讖骄?，避免了配膠條件不一致對(duì)測序精度的影響。它主要由毛細(xì)管電泳裝置,、Macintosh電腦,、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集,，分析和儀器運(yùn)行等軟件,。它使用的CCD攝影機(jī)檢測器，使DNA測序縮短至2.5h,，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min,。
由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能,，因此可進(jìn)行DNA測序,、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP),、微衛(wèi)星序列分析,、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測序外,，還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測,、HLA配型,、法醫(yī)學(xué)上的親子和個(gè)體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等,。
【試劑與器材】
1．BigDye測序反應(yīng)試劑盒 主要試劑是BigDye Mix,，內(nèi)含PE四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS,，反應(yīng)緩沖液等。
2．pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對(duì)照模板 0.2g/L,，試劑盒配套試劑,。
3．M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl,，試劑盒配套試劑,。
4．DNA測序模板 可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等,。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時(shí)取量1μl為宜,。本實(shí)驗(yàn)測定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2g/L,，即200ng/μl,。
5．引物 需根據(jù)所要測定的DNA片段設(shè)計(jì)正向或反向引物，配制成3.2μmol/L,，即3.2pmol/μl,。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物,，T7引物等,。
6．滅菌去離子水或三蒸水。
7．0.2ml或和0.5ml的PCR管 蓋體分離,，PE公司產(chǎn)品,。
8．3mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至5.2,，定容至100ml,，高壓滅菌后分裝。
9．70%乙醇和無水乙醇,。
10．NaAc/乙醇混合液 取37.5ml無水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混勻,，室溫可保存1年。
11．POP 6測序膠 ABI產(chǎn)品,。
12．模板抑制試劑(TSR) ABI產(chǎn)品,。