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甲基化檢測(cè)方法（亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法）
點(diǎn)擊次數(shù)：2063 發(fā)布時(shí)間：2016-5-3
甲基化是目前的研究熱點(diǎn),，就我所做的一點(diǎn)工作并其中一點(diǎn)心得,，與大家分享。希望能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭?br />*部分 基因組DNA的提取,。
這一步?jīng)]有懸念,，*可以購買供細(xì)胞或組織使用的dna提取試劑盒，如果實(shí)驗(yàn)室條件成熟,，自己配試劑提取*可以,。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力,，提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的,。
此步重點(diǎn)在于DNA的純度，即減少或避免RNA,、蛋白的污染很重要,。因此在提取過程中需使用蛋白酶k及RNA酶以去除兩者。
使用兩者的細(xì)節(jié)：
1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml,；
2：rna酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶,，即在購買市售RNA酶后進(jìn)行再處理，配制成10mg/ml,。否則可能的后果是不僅沒有RNA,，連DNA也被消化了。兩者均于-20度保存,。
驗(yàn)證提取DNA的純度的方法有二：
1：紫外分光光度計(jì)計(jì)算OD比值,；
2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
我傾向于第二種方法,，這種方法*可以明確所提基因組DNA的純度,，并根據(jù)Marker的上樣量估計(jì)其濃度,，以用于下一步的修飾。
第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA
如不特別指出,，所用雙蒸水（DDW）均經(jīng)高壓蒸汽滅菌,。
1：將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul；
2：加5.5ul新鮮配制的3M NaOH,；
3： 42℃水浴30min,；
水浴期間配制：
4：10mM對(duì)苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴后混合液中,；（溶液變成淡黃色）
5： 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma,，S9000），配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋,，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0,，zui終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶,，但加入NaOH后會(huì)慢慢溶解,，需要有耐心。PH一定要準(zhǔn)確為5.0,。加520ul至上述水浴后溶液中,。
6：EP管外裹以鋁箔紙，避光,，輕柔顛倒混勻溶液,。
7：加200 ul 石蠟油,，防止水分蒸發(fā),，限制氧化。
8：50℃避光水浴16h,。
一般此步在4pm開始做,，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收,，時(shí)間上很合適,。
這一步細(xì)節(jié)：
1：基因組DNA的量不需十分，寧多勿少,，因?yàn)樵谝院蠹兓厥詹襟E中會(huì)有丟失,，且此方法修飾zui多可至4ug。
2：所有試劑均須新鮮配制,，所以配液的技術(shù)要過關(guān),，既要快，又要,。
3：亞硫酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性,，一定用堿將PH調(diào)制5.0,，否則PH不合適會(huì)影響后續(xù)純化吸收。
4：水浴達(dá)16小時(shí),，雖可以短至8小時(shí),，但后者修飾會(huì)有不*。
第三部分 修飾后DNA純化回收
EP管如無特別說明均為高壓蒸汽滅菌的,。
1. 將移液器槍頭伸入石蠟油層下,，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然后吸取混合液至一潔凈1.5mlEP管中,。
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA純化回收系統(tǒng)（Promega,，A7280）
1）70℃水浴預(yù)熱DDW；配制80%異丙醇,；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin,，輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結(jié)合,；
3）由于該試劑盒中僅配備針筒沒有針?biāo)?，如果有真空?fù)壓吸引器，使用起來很方便,；如果沒有,，需要自備3ml-5ml注射器。將注射器針筒與試劑盒提供的回收小柱緊密連接后,，將上述混合物用移液器移至針筒內(nèi),，用2ml以上的EP管放置小柱下接收廢液。加針?biāo)?，輕輕加壓,，將液體擠出，此時(shí)可見小柱內(nèi)有白色的樹脂沉積,。
4）將注射器與小柱分離后拔出針?biāo)?，再將針筒與小柱連接，向針筒內(nèi)加入2ml 80％的異丙醇,，插入針?biāo)?，輕輕加壓，將異丙醇擠出,。此為洗滌步驟,。
5）將注射器與小柱分離，將小柱置于潔凈1.5ml潔凈EP管上,，離心12000rpm,，2min，以甩去殘余異丙醇成分,，使樹脂干燥,。此時(shí),，修飾后DNA處于與樹脂結(jié)合狀態(tài)。
6）將小柱取下置于另一潔凈1.5mlEP管上,，移液器加50ul預(yù)熱好的DDW,，室溫放置5min。
7）離心12000rpm,，20s,，此為洗脫步驟，此時(shí)EP管內(nèi)液體即為洗脫的修飾后DNA溶液,，終體積為50ul,。
3：加5.5ul 新鮮配制的3M NaOH，室溫放置15min,。
4：加33ul 10M乙酸銨,，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右,。