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如何從RNA抽提到電泳鑒定
點擊次數(shù)：1266 發(fā)布時間：2016-4-14
RNA抽提
一,，準(zhǔn)備工作
1,， 實驗器具與材料：
（1） 移液槍：1ml、200ul,、10ul
（2） 吸頭：1ml,、200ul、20ul
（3） 吸頭臺：放置1ml吸頭的一個,，放置200ul和20ul的吸頭一個
（4） EP管1.5ml,、100ul
（5） 玻璃研磨器
（6） 容量瓶：1000ml
（7） 鹽水瓶：100ml
（8） 15ml塑料管一個（配75％乙醇用）
2， 實驗器具的處理與準(zhǔn)備
（1） 塑料制品：（包括吸頭,、EP管等）
將塑料制品逐個浸泡于1‰DEPC水中（必要時小槍頭需要用吸管打入DEPC水）37℃,，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時左右烘干）,，試驗前將槍頭放入吸頭臺,。
（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）
先泡酸，沖洗干凈后,，在1‰DEPC水中泡8小時左右,，37℃烘干，用蒙錫紙包裹送至干烤3次,。
（3） 金屬制品：（鑷子等）
先洗干凈,，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）
3,， 試劑配制和準(zhǔn)備：
（1） DEPC水：泡實驗器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC,，放在1000ml容量瓶中靜置4小時后備用,。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶內(nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC,，37℃,，送至高壓。
（2） 75％乙醇（要在抽提時現(xiàn)配）：用無水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:無水乙醇＝1:3）,，然后放于-20℃?zhèn)溆谩?/span>
（3） 異丙醇：放入棕色瓶
（4） 氯仿：放入棕色瓶
（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃
二,，抽提時注意事項：
全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤換,，避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物,。
三，抽提步驟
1．勻漿化作用
取約100mg鼠腦組織放于玻璃研磨器內(nèi),，先加0.2ml的Trizol溶液,，研磨組織后，倒入1.5mlEP管中,，再在研磨器內(nèi)加入0.8ml的Trizol溶液洗,，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻10下,，室溫靜置5分鐘,。
2．分離階段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿,。蓋緊樣品管蓋,，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻,，室溫靜置5分鐘,。后12000rmp離心15分鐘。
3．RNA的沉淀
將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中（約400-500ul）,，加入0.5ml異丙醇,，混勻后放于-20℃中1小時，后12000rmp離心10分鐘,。
4．RNA的洗脫
小心倒掉上清,，留取沉淀。加1ml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次,，后7500rmp離心5分鐘,。
5．RNA的再溶解
小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺開風(fēng)機吹干（約30分鐘,，此時RNA沉淀變透明）,。注意不能讓RNA沉淀*干燥（會極大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解,，在55-60℃下孵育10分鐘助溶,。
6,，RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄,。
TRIzol法抽提總RNA細(xì)胞
組織100mg 1×107
↓
加1mlTRIzol
↓細(xì)胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無細(xì)胞團塊
勻漿（要*,，后轉(zhuǎn)至EP管）
（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鐘
↓
加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）
↓
顛倒混勻15S,，室溫5分鐘
↓
4℃,，離心12000rmp，15分鐘
↓
轉(zhuǎn)上層水相（約400-500μl）于另一新1.5mlEP管中
↓
加等體積異丙醇（約400 -500μl）,，混勻后-20℃中1小時
↓
4℃,，離心12000rmp，10分鐘
↓
棄上清
↓
加冰預(yù)冷的75%乙醇（用高壓后的DEPC水配）1ml
↓
4℃離心7500rmp,，5分鐘
↓
棄上清,，超凈工作臺開風(fēng)機干燥約30分鐘（不能*干燥）
↓
溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）
↓
立即保存于-70℃超低溫冰箱中,，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄