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siRNA的設(shè)計與制備
點擊次數(shù)：1640 發(fā)布時間：2016-4-6
一．sirna的設(shè)計
在制備siRNA前都需要單獨設(shè)計siRNA序列,。研究發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞，zui有效的siRNAs是21-23個堿基大小,，3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA,；而對非哺乳動物細(xì)胞，比較有效的是長片段dsRNA,。siRNA的序列專一性要求非常嚴(yán)謹(jǐn),，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。
選擇siRNA靶位點：
從轉(zhuǎn)錄本AUG起始密碼子開始,，搜尋下游AA序列,，記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷酸作為侯選的siRNA靶位點,。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5’端和3’端的非編碼區(qū)（untranslated regons, UTRs）,，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域,，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。
序列同源分析：
將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人,，或者小鼠,，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列,。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成,。并非所有符合條件的siRNA都一樣有效，其原因還不清楚,，可能始位置效應(yīng)的結(jié)果,，因此對于一個目的基因，一般要選擇3-5個靶位點來設(shè)計siRNA,。通常來說,，每個目標(biāo)序列設(shè)計3-4對siRNAs，選擇zui有效的進(jìn)行后續(xù)研究,。
設(shè)計陰性對照：
一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有陰性對照,，作為陰性對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性,。通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂,。當(dāng)然，同樣要保證它和其他基因沒有同源性,。
此外網(wǎng)上提供提供免費的siRNA設(shè)計工具www.qiagen,。。ｃｏｍ/siRNA,
http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/
二．siRNA的獲得
1．化學(xué)合成
盡管化學(xué)合成siRNA是zui貴的方法,，但卻是zui方便的---研究人員幾乎不需要做什么工作就可以拿到高質(zhì)量的siRNA,。如QIAGEN-Xeragon公司可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA（可帶標(biāo)記）。它zui適用的情況是：已經(jīng)找到zui有效的siRNA序列,，需要大量siRNA進(jìn)行研究,。QIAGEN還提供siRNA設(shè)計合成一體化服務(wù)“4-for Silencing siRNA duplexes” : 針對客戶給出的一個基因序列，由QIAGEN的專家設(shè)計并合成4對siRNA,，HPP純度,，保證至少一對抑制效率達(dá)到70%以上，如果達(dá)不到,，免費為客戶另行設(shè)計合成另外4對siRNA,。
siRNA的設(shè)計與制備
Figure 1. HeLa-S3 cells were plated out in 24-well plates at a density of 6×104 cells in each well, 24 hours after transfection. Cells were transfected with lamin A/C siRNA using the transfection reagents indicated, according to the manufacturer’s protocol. mRNA was purified from the cells 48 hours after transfection and quantitative RT-PCR was performed using the QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit eith primers targeted to lamin.