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RAPD技術(shù)及其在假絲酵母菌研究中的應(yīng)用
點擊次數(shù)：876 發(fā)布時間：2016-3-16
近年來,，隨著腫瘤,、自身免疫病、器官移植,、糖尿病,、獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）等患者的不斷增多,，侵入性診斷治療手段的廣泛實施,，各類免疫抑制劑和廣譜、超廣譜抗生素的大量使用,，臨床上真菌感染呈明顯上升趨勢［1］,，其中假絲酵母菌在醫(yī)院真菌感染中zui常見，占80%以上［2］,，故快速,、準(zhǔn)確地對其鑒定、分型并分析該菌種間,、種內(nèi)的親緣關(guān)系對研究假絲酵母菌的致病性,、藥物敏感性、預(yù)防監(jiān)測流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義,。傳統(tǒng)的真菌分型方法主要是表型分型如形態(tài)學(xué)法,、血清學(xué)法、藥物敏感性分型等，但耗時費力,，易受環(huán)境及人為因素的影響,，鑒別力弱，穩(wěn)定性差,。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,，DNA分析技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測，如：限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）,，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）,，隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD），脈沖場凝膠電泳等,，其中RAPD技術(shù)具有簡便快速,，短期內(nèi)可以分析大量樣本等特點，在醫(yī)學(xué)真菌研究中顯示出巨大的潛力,。
1 RAPD的基本原理
隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分型法（random amplied polymorphic DNA,RAPD）又稱任意酶鏈反應(yīng)(Arbitrily primer PCR,AP-PCR),，由Williams等［3］于1990年創(chuàng)用，該方法利用任意10個左右的寡聚核苷酸鏈作引物,，以所研究的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，擴(kuò)增產(chǎn)物（即DNA片段）通過瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙腚（EB）染色檢測多態(tài)性,，在擴(kuò)增條件相同的情況下,，不同種屬的個體基因組成相差明顯，擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)不同電泳帶型,，同種內(nèi)不同個體由于基因突變,、插入、缺失或置換影響引物的特定結(jié)合位點,，導(dǎo)致DNA擴(kuò)增條帶增多,、減少或長度改變，而同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的被認(rèn)為具有同源性,，因此不僅反映生物個體之間的遺傳穩(wěn)定性,，也能同時清晰敏感地反映出遺傳差異。
2 RAPD技術(shù)的主要優(yōu)勢
RAPD方法建立在PCR基礎(chǔ)之上,，因此具有模板用量少,、技術(shù)簡單、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點,，但與其他DNA多態(tài)分析方法相比較,，還有其*的優(yōu)勢。
*,，RAPD勿需知道模板DNA任何序列信息,，對其進(jìn)行擴(kuò)增,，構(gòu)建不同種、不同菌株的基因指紋圖譜,，進(jìn)而分析DNA的多態(tài)性,，這是其他方法進(jìn)行此類研究所不能比擬的［4］。
第二,，鑒別力強(qiáng),。Bostock［5］等將RAPD與PFGE、REA-RFLPs進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)15株白假絲酵母菌中,，PFGE產(chǎn)生14個電泳核型,，E.CORI-RFLPs產(chǎn)生7種不同的DNA型別,而RAPD則能分出13個亞型，是一種快速簡捷的方法并有著與PFGE類似的分辨力,。隨后許多學(xué)者進(jìn)行了類似的研究［6-8］,，對RAPD予以高度評價，認(rèn)為目前已有的分型方法中,，RAPD可能是*位選擇,。
第三，RAPD技術(shù)無需DNA探針,，不涉及Southern雜交,，放射自顯影或其他技術(shù)，操作步驟少,，實驗周期短,，成本較低，能在較短的時間內(nèi)篩選大量樣品,。
3 RAPD技術(shù)在假絲酵母菌研究中的應(yīng)用
3.1 用于種間及種內(nèi)菌株分型 假絲酵母菌是條件致病菌感染中zui常見菌群,，其種間及種內(nèi)分型具有重要的流行病學(xué)及臨床意義。Robert［9］等應(yīng)用1個10bp隨機(jī)引物RAPD方法將分離自非相關(guān)患者不同解剖部位的32株白假絲酵母菌分成22個不同的DNA型別,。項明潔等［10］采用優(yōu)化實驗條件對自上海瑞金醫(yī)院臨床分離的22株酵母菌菌株進(jìn)行RAPD分析,，從而得到假絲酵母菌具有不同的擴(kuò)增指紋，進(jìn)而揭示了RAPD在酵母菌分型中的應(yīng)用,。廉翠紅等［11］利用兩條隨機(jī)引物RAPD方法,，將來源于不同陰道念珠菌病患者的97株臨床分離株分別分成19個和21個型別,?？梢姡琑APD具有很好的分型能力,。