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技術(shù)文章
特定基因表達(dá)水平的檢測(cè)
點(diǎn)擊次數(shù)：1066 發(fā)布時(shí)間：2016-1-25
繼分析DNA的southern雜交方法出現(xiàn)后,，1977年Alwine等人提出一種與此相類似的、用于分析細(xì)胞總RNA或含polyA尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術(shù),，這就是與Southern相對(duì)應(yīng)而定名的Northern雜交技術(shù),。這一技術(shù)自出現(xiàn)以來，已得到廣泛應(yīng)用,，成為分析mRNAzui為常用的經(jīng)典方法,。
與Southern雜交相似，Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳,，將分子量大小不同的RNA分離開來,，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上,，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的DNA或RNA探針,，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，zui后進(jìn)行放射自顯影（或化學(xué)顯影）,，以目標(biāo)RNA所在位置表示其分子量的大小,，而其顯影強(qiáng)度則可提示目標(biāo)RNA在所測(cè)樣品中的相對(duì)含量（即目標(biāo)RNA的豐度）。但與Southern雜交不同的是,，總RNA不需要進(jìn)行酶切,，即是以各個(gè)RNA分子的形式存在，可直接應(yīng)用于電泳,；此外,，由于堿性溶液可使RNA水解，因此不進(jìn)行堿變性,，而是采用甲醛等進(jìn)行變性電泳,。雖然Northern也可檢測(cè)目標(biāo)mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測(cè)目的基因在組織細(xì)胞中有無表達(dá)及表達(dá)的水平如何,。
一,、試劑準(zhǔn)備
1、0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH2O至80ml,調(diào)pH至8.0,定容至100ml,。
2,、50mMNaAc:NaAc3.4g加ddH2O至500ml,加DEPC0.5ml,振蕩,37℃,，高壓滅菌。
3,、5×甲醛凝膠電泳緩沖液:MOPS[3-(N-瑪琳代)丙磺酸]10.3g加50mMNaAc400ml,用2NNaOH調(diào)pH至7.0,再加入0.5MEDTA10ml,加DEPCH2O至500ml,。無菌抽濾，室溫避光保存,。
4,、20×SSC:NaCl175.3g、檸檬酸三鈉88.2g,，加ddH2O至800ml,，用2NNaOH調(diào)pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml,。DEPC處理、高壓滅菌,。
5,、6×SSC:20×SSC300ml加ddH2O至1000ml,。DEPC處理,高壓滅菌,。
6、50×Denhardt:聚蔗糖0.5g,、聚乙烯吡咯烷酮0.5g,、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加ddH2O至50ml,無菌抽濾、分裝,。
7,、1MNa2HPO4:Na2HPO4•12H2O35.81g,加ddH2O至100ml。
8,、1MNaH2PO4:NaH2PO4•2H2O15.6g,加ddH2O至100ml,。
9,、0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6):Na2HPO435.2ml加NaH2PO464.8ml,。
10、STE緩沖液:1MTris-HCl(pH8.0)2.5ml,0.5MEDTA,0.5ml,5MNaCl5ml,，加ddH2O至250ml,。
11、預(yù)雜交液:20×SSC5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt4ml,1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6）,10%SDS1ml,總體積20ml,。臨用前加入變性鮭魚精DNA（10mg/ml）,使終濃度為4μl/ml,。
12、DEPCH2O:1000mlddH2O中加入DEPC1ml,，充分振蕩,，37℃,，高壓滅菌。
與Southern雜交相似，Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳,，將分子量大小不同的RNA分離開來,，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上,，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的DNA或RNA探針,，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，zui后進(jìn)行放射自顯影（或化學(xué)顯影）,，以目標(biāo)RNA所在位置表示其分子量的大小,，而其顯影強(qiáng)度則可提示目標(biāo)RNA在所測(cè)樣品中的相對(duì)含量（即目標(biāo)RNA的豐度）。但與Southern雜交不同的是,，總RNA不需要進(jìn)行酶切,，即是以各個(gè)RNA分子的形式存在，可直接應(yīng)用于電泳,；此外,，由于堿性溶液可使RNA水解，因此不進(jìn)行堿變性,，而是采用甲醛等進(jìn)行變性電泳,。雖然Northern也可檢測(cè)目標(biāo)mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測(cè)目的基因在組織細(xì)胞中有無表達(dá)及表達(dá)的水平如何,。
一,、試劑準(zhǔn)備
1、0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH2O至80ml,調(diào)pH至8.0,定容至100ml,。
2,、50mMNaAc:NaAc3.4g加ddH2O至500ml,加DEPC0.5ml,振蕩,37℃,，高壓滅菌。
3,、5×甲醛凝膠電泳緩沖液:MOPS[3-(N-瑪琳代)丙磺酸]10.3g加50mMNaAc400ml,用2NNaOH調(diào)pH至7.0,再加入0.5MEDTA10ml,加DEPCH2O至500ml,。無菌抽濾，室溫避光保存,。
4,、20×SSC:NaCl175.3g、檸檬酸三鈉88.2g,，加ddH2O至800ml,，用2NNaOH調(diào)pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml,。DEPC處理、高壓滅菌,。
5,、6×SSC:20×SSC300ml加ddH2O至1000ml,。DEPC處理,高壓滅菌,。
6、50×Denhardt:聚蔗糖0.5g,、聚乙烯吡咯烷酮0.5g,、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加ddH2O至50ml,無菌抽濾、分裝,。
7,、1MNa2HPO4:Na2HPO4•12H2O35.81g,加ddH2O至100ml。
8,、1MNaH2PO4:NaH2PO4•2H2O15.6g,加ddH2O至100ml,。
9,、0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.6):Na2HPO435.2ml加NaH2PO464.8ml,。
10、STE緩沖液:1MTris-HCl(pH8.0)2.5ml,0.5MEDTA,0.5ml,5MNaCl5ml,，加ddH2O至250ml,。
11、預(yù)雜交液:20×SSC5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt4ml,1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6）,10%SDS1ml,總體積20ml,。臨用前加入變性鮭魚精DNA（10mg/ml）,使終濃度為4μl/ml,。
12、DEPCH2O:1000mlddH2O中加入DEPC1ml,，充分振蕩,，37℃,，高壓滅菌。