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Southern印跡雜交
點擊次數(shù)：1386 發(fā)布時間：2016-1-12
實驗原理
核酸分子雜交技術(shù)是分子生物學領(lǐng)域中zui常用的具體方法之一,。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則形成雙鏈,，此雜交過程是高度特異的,。由于核酸分子的高度特異性及檢測方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果,，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖,，或進行目的基因序列的測定以滿足基因克隆的特殊要求,，還必須掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置。有關(guān)這類數(shù)據(jù)資料可應(yīng)用Southern印跡雜交技術(shù)獲得,。
Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個主要過程：一是將待測定核酸分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上,，即印跡（blotting）;二是固定于膜上的核酸同位素標記的探針在一定的溫度和離子強度下退火，即分子雜交過程,。該技術(shù)是1975年英國愛丁堡大學的E.M.Southern*的,，Southern印跡雜交故因此而得名。
早期的Southern印跡是將凝膠中的DNA變性后,，經(jīng)毛細管的虹吸作用,，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。近年來印跡方法和固定支持濾膜都有了很大的改進,，印跡方法如電轉(zhuǎn)法,、真空轉(zhuǎn)移法,；濾膜則發(fā)展了尼龍膜、化學活化膜（如APT,、ABM纖維素膜）等,。利用Southern印跡法可進行克隆基因的酶切、圖譜分析,、基因組中某一基因的定性及定量分析,、基因突變分析及限制性片斷長度多態(tài)性分析（RFLP）等。
實驗方法
本節(jié)以哺乳動物基因組DNA為例,，介紹的基本步驟,。
一、 待測核酸樣品的制備
（一） 制備待測DNA
基因組DNA是從動物組織（或）細胞制備,。1. 采用適當?shù)幕瘜W試劑裂解細胞,，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細胞；2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA,；3. 用有機試劑（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白質(zhì),。
（二） DNA限制酶消化
基因組DNA很長，需要將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析,，通常用限制酶消化DNA,。一般選擇一種限制酶來切割DNA分子，但有時為了某些特殊的目的,，分別用不同的限制酶消化基因組DNA,。切割DNA的條件可根據(jù)不同目的設(shè)定，有時可采用部分和充分消化相結(jié)合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段,。
消化DNA后,，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進行電泳分離,，必要時可進行乙醇沉淀,，濃縮DNA樣品后再進行電泳分離。
二,、 瓊脂糖凝膠電泳分離待測DNA樣品
（一） 基本原理
是先將DNA樣品(含不同大小的DNA片段)先按片斷長短進行分離,，然后進行雜交。這樣可確定雜交靶分子的大小,。因此,，制備DNA樣品后需要進行電泳分離。
在恒定電壓下,，將DNA樣品放在0.8～1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳,，標準的瓊脂糖凝膠電泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可對DNA片段進行分離,。但需要用不同的膠濃度來分辨這個范圍內(nèi)的不同的DNA片段,。原則是分辨大片斷的DNA需要用濃度較低的膠,，分辨小片段DNA則需要濃度較高的膠。
瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖形成的網(wǎng)狀物質(zhì),，具有分子篩作用,。在相應(yīng)的電泳緩沖液中，DNA在電場的作用下由負極向正極泳動,，分子越大,，泳動速度越慢；反之,，分子小則泳動速度快,，而大小相同的分子則泳動速度相同。因此在恒定的電場下,，經(jīng)過一段時間電泳后,，DNA按分子大小在凝膠中形成許多條帶，大小相同的分子處于同一條帶,。另外為了便于測定待測DNA分子量的大小,，往往同時在樣品鄰近的泳道中加入已知分子量的DNA樣品即標準分子量DNA （DNA marker）進行電泳。DNA marker可以用放射性核素進行末端標記,，通過這種方式,，雜交后的標準分子量DNA也能顯影出條帶。
在制備凝膠和電泳過程中需要注意的幾個問題是：*,、盡可能在使用之前配制新鮮凝膠,；第二、如果使用的膠比較薄,，鋪膠后1h內(nèi)使用,；第三、膠中不要含有EB,，否則會引起非特異性背景,；第四、電泳結(jié)束后用1μg/ml的EB染色,，然后用水脫色（如果膠里含的是RNA，則使用無RNA酶的水）,，以保證核酸的完整性,。
（二） 基本步驟
1. 制備瓊脂糖凝膠，盡可能薄,。
DNA樣品與上樣緩沖液混勻,，上樣。推薦使用的靶基因的上樣量見下表：
表4－1 不同條件下上樣本的使用指針比較表