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轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆基因的改進
點擊次數(shù)：1259 發(fā)布時間：2015-12-31
1 轉(zhuǎn)座子及轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆基因
基因標(biāo)簽法克隆植物組織中的基因是較為常用的一種方法，T-DNA和轉(zhuǎn)座子均可作為基因標(biāo)簽,。
轉(zhuǎn)座子zui早由美國的細胞遺傳學(xué)家Mc-clintock在玉米中發(fā)現(xiàn),，它是指基因組中一段特定DNA片段，能在轉(zhuǎn)位酶的作用下從基因組的一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點,。轉(zhuǎn)座子不僅能在本基因組中轉(zhuǎn)座，也能轉(zhuǎn)入其它植物的基因組中,。轉(zhuǎn)座的結(jié)果是使被轉(zhuǎn)入的基因失活,，從而有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生表型突變株。然后構(gòu)建一個對應(yīng)于突變株的基因庫,，用作標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座子作為探針從基因庫中篩選相對應(yīng)的克隆,，分離得到相對應(yīng)于變異的基因,，這就是轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽克隆基因。
玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座子家族是研究較為深入的植物轉(zhuǎn)座子,。
2 Ac,、Ds轉(zhuǎn)座子作基因標(biāo)簽時遇到的問題
2．1 Ac屬于自主性轉(zhuǎn)座子，自己能編碼轉(zhuǎn)位酶,，因此可直接用于基因標(biāo)簽,。但是由于Ac能自由地在基因組中轉(zhuǎn)座，結(jié)果使轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的變異不穩(wěn)定,，給確定和分析突變基因帶來困難,。
2．2 Ds屬非自主性轉(zhuǎn)座子，本身不能編碼轉(zhuǎn)位酶,，必須依靠Ac轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生的轉(zhuǎn)位酶才能產(chǎn)生轉(zhuǎn)座,，因此Ds只有和Ac聯(lián)合使用才能做為基因標(biāo)簽。
2．3 Ac和Ds聯(lián)合使用后遇到的問題是Ac本身的轉(zhuǎn)座成為除Ds之外又一個轉(zhuǎn)座因素,，因此產(chǎn)生突變后,，要首先經(jīng)過遺傳分析確定突變因子是哪一個轉(zhuǎn)座子，才能用探針進行篩選克隆,，這就增加了分離基因的難度和工作量,。另外，Ac和Ds同時存在情況下,，Ds能在Ac產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶作用下頻繁轉(zhuǎn)位,，難以產(chǎn)生穩(wěn)定的突變，這又產(chǎn)生了與Ac單獨使用時存在的問題,。
2．4 由以上分析,，轉(zhuǎn)座子Ac和Ds聯(lián)合使用時必須從兩方面進行改進：首先，如何使Ac穩(wěn)定下來,，即只有產(chǎn)生轉(zhuǎn)位酶的能力而無轉(zhuǎn)座的能力,，從而減少產(chǎn)生突變的轉(zhuǎn)座子種類。此外,，如何使Ds轉(zhuǎn)座后,，將產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶的Ac分離，從而使Ds穩(wěn)定下來,，不再轉(zhuǎn)座,，使產(chǎn)生的變異得到穩(wěn)定。人們對Ac,、Ds進行改進后,，發(fā)展了一種稱為sAc/Ds的雙系統(tǒng)法。
3 sAc/Ds雙系統(tǒng)法
3．1 對Ac的改進 Ac是一段長約為4.5kb的DNA片段,，人為將其末端轉(zhuǎn)位必須的一段DNA序列切除后,，它就不能再借助于轉(zhuǎn)位酶進行轉(zhuǎn)位,，但仍能正常編碼轉(zhuǎn)位酶，這種修飾后的Ac稱為穩(wěn)定的Ac(StableAc,，sAc),。sAc產(chǎn)生的轉(zhuǎn)位酶量可由放在轉(zhuǎn)位酶基因之前的啟動子控制，從而控制Ds在基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)位頻率,。如果用Ac本身的啟動子,，其作用較弱，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)位酶少,，Ds轉(zhuǎn)座的頻率較低,，轉(zhuǎn)變產(chǎn)生的突變就比較穩(wěn)定。如果用強啟動子,，則轉(zhuǎn)位酶活力高,，Ds轉(zhuǎn)位頻繁，產(chǎn)生的變異頻率較高,。同時為了篩選sAc的轉(zhuǎn)化株還需要在Ac上克隆一個標(biāo)記基因,。用于sAc/Ds雙系統(tǒng)法中sAc的構(gòu)建方法略。
3．2 對Ds的改進 對Ds改進的目的有兩個：第1,，能方便地檢測Ds是否已經(jīng)從原位置轉(zhuǎn)座,；第2，能檢測到Ds是否已轉(zhuǎn)移到基因組的另一個位置,。改進的方法是首先將Ds克隆到一個標(biāo)記基因的啟動子和密碼子之間,，這樣可以通過篩選對抗生素的抗性來檢測Ds是否已經(jīng)轉(zhuǎn)座。另外在不影響Ds轉(zhuǎn)座能力的前提下,，在Ds的DNA序列中間克隆上另一個標(biāo)記基因,，這個基因?qū)⑴cDs一起轉(zhuǎn)座，這樣就可以篩選對這一基因的抗性來檢測Ds是否已經(jīng)轉(zhuǎn)座和轉(zhuǎn)座的位置,。
3．3 sAc/Ds雙系統(tǒng)法克隆基因的原因及步驟
1)將sAc和Ds分別與T-DNA連接,，在農(nóng)桿菌的幫助下分別轉(zhuǎn)入植物中，獲得sAc的轉(zhuǎn)化植株和Ds的轉(zhuǎn)化植株,。 2)將sAc轉(zhuǎn)化株與Ds轉(zhuǎn)化株雜交,，挑選同時含有sAc和Ds的子一代植株。
3)雜合植株中,，Ds在sAc產(chǎn)生的轉(zhuǎn)位酶幫助下轉(zhuǎn)座,，引起某個基因突變，從而產(chǎn)生表型突變株,。
4)通過突變植株的自交和回交,，選擇僅含有Ds而無sAc的植株，從而使變異得到穩(wěn)定,。建立對應(yīng)于變異株的基因文庫或cDNA文庫,。
5)用IPCR的方法擴增與Ds相鄰的DNA片段，利用此片段作探針直接從基因文庫或cDNA文庫中篩選對應(yīng)的基因克隆,，通過DNA測序和比較了解該基因的特征,。
6)穩(wěn)定的變異株再與sAc轉(zhuǎn)化株雜交，使得Ds再次轉(zhuǎn)位,，使突變的基因得到恢復(fù),，從而得到回復(fù)突變株，用于檢驗所得到的基因是否對應(yīng)于變異的基因,。
4 sAc/Ds雙系統(tǒng)法的應(yīng)用
用sAc/Ds雙系統(tǒng)法克隆基因,，容易得到回復(fù)突變株和容易產(chǎn)生再次突變克隆其它基因，與T-DNA做基因標(biāo)簽相比省去了再次轉(zhuǎn)化的繁瑣程序,，為克隆基因的工作帶來了極大方便,。
理論上用sAc/Ds雙系統(tǒng)法克隆基因如果有足夠的轉(zhuǎn)化株，能克隆到任何一個基因,，另外這種方法還可用于定點突變,。如果對某一基因我們不知道它的表達產(chǎn)物，也不知道它何時在何部位表達,，sAc/Ds雙系統(tǒng)法是一種較好的克隆基因的方法,，該方法以其*的優(yōu)點在克隆基因工作中將得到更廣泛的應(yīng)用。