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質(zhì)粒的酶切鑒定及片段回收
點(diǎn)擊次數(shù)：1578 發(fā)布時(shí)間：2015-12-24
一,、小量酶解反應(yīng)
主要應(yīng)用于質(zhì)粒的酶切鑒定。10ul反應(yīng)體積中含1mg DNA,，酶切反應(yīng)體系如下：
質(zhì)粒dna 1mL
10×緩沖液 1mL
兩種限制酶各 0.5mL +0.5mL
雙蒸去離子水 7mL
總體積 10mL
[操作方法]
按下列順序加入試劑：
(1)在一滅菌的新的Ep管中加入7ul雙蒸水,。
(2)加入10×緩沖液1mL 。
(3)加限制酶Kpn I 0.5mL,，Sac I 0.5mL。
(4)zui后加入質(zhì)粒DNA lmL,。
(5)稍離心,，混合。
(6)37℃水浴1—1.5h,。
(7)取出后電泳分析鑒定是否酶解,。
[注意事項(xiàng)]
(1)雙蒸水為可變體積，當(dāng)其它反應(yīng)成分確定后,，用雙蒸水將反應(yīng)體積補(bǔ)足,。
(2)質(zhì)粒DNAzui后加入，以防止操作不當(dāng)引起試劑的污染,。
(3) 大多數(shù)限制酶均加50％甘油緩沖液置于-20℃保存,，其活力，穩(wěn)定,，但在配制反應(yīng)混合物時(shí),，酶的加入量要準(zhǔn)確限制小于總體積的l／10,，否則甘油會(huì)抑制酶解反應(yīng)。
二,、凍溶法從瓊脂糖凝膠中回收DNA
在重組DNA或探針標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)中,，常常需要從凝膠中回收和純化DNA，常用的回收方法有：壓碎浸泡法,、透析袋洗脫法,、低熔點(diǎn)瓊脂糖法和DEAE—纖維素膜法等。
[操作方法]
(1) 從瓊脂糖凝膠中將含有擬回收DNA片段的膠塊切下,，置于Ep管內(nèi),。
(2) 用一次性注射器將膠由針頭處擠入Ep管內(nèi)，加等體積Tris平衡酚混勻后,，置液氮10min,。
(3) 取出離心，5000g,，5min,。
(4) 小心地將水相轉(zhuǎn)移至另一Ep管中。
(5) 加等體積酚：氯仿（1：1）充分混勻,。離心,，5000g，5min,。
(6) 將水相轉(zhuǎn)移Ep管中,，加等體積氯仿：異戊醇（49：1）充分混勻。
(7) 離心,，5000g,，5min。
(8) 在轉(zhuǎn)移出的水相中加1／10體積3mol乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇置-30℃30min,。
(9) 離心,，12000g，15min．
(10)棄上清,，加預(yù)冷的70％乙醇1ml,，12000g，離心5min,。棄上清,，室溫放置數(shù)分鐘。
(11)將沉淀用20ul TE緩沖液(pH8.0)溶解,，-20℃保存?zhèn)溆谩?/em>