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DNA重組技術(shù)一：酶切、連接
點擊次數(shù)：1457 發(fā)布時間：2015-12-21
實驗原理: DNA重組技術(shù)是用內(nèi)切酶分別將載體和外源DNA切開,，經(jīng)分離純化后,，用鏈接酶將其連接，構(gòu)成新的DNA分子,。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA,。如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。
5’…G↓AATTC…3’ →5’… G AATTC…3’
3’…CTTAA↑G …5’ →3’… CTTAA G…5’
構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法,。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶,，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴于它的準確性和程度,。
限制性內(nèi)切酶的一個活性單位U
理論上,， 1hr,切1ug DNA 樣品中所有專一位點的所用酶量實際反應，1U酶：能*切割1ul λDNA的一個位點不能* 切割1ug 帶有4個酶切位點的樣品和不純的樣品.
如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的zui適鹽濃度,。若兩者可用同一緩沖液,則可同時水解,。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。
限制性內(nèi)切酶的使用注意事項：
10x bf o 無鹽
注意混勻 L 低鹽
H 高鹽
一.儀器
水浴鍋(37℃,，65℃) 凝膠電泳 滅菌鍋 紫外檢測 離心機
二.試劑及溶液
λ DNA EcoR I
pUC18 無菌水
終止液 (40%蔗糖) 70％,，100％酒精
3Mol/L KAc(pH5.2) ICE
瓊脂糖 溴酚藍
TE TAE
EB marker
三. 用品
移液器 20ul 一次性手套
tip 20ul 防護鏡
離心管 0.5ml 吸水紙
膠帶 浮子
PUC 18/19, λDNA
2人／組,，一人做 PUC18 酶切 （20ug） Takara 25ug/個
一人作λDNA 酶切 （15ug）
EcoR1 1ul/人 （10 u） (20ul) Takara 4000u/個
四：酶切反應:
DNA純度、緩沖液,、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性,。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當微量的污染物進入限制性內(nèi)切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時,每次都要用新的吸管頭.
[注意]
1.酶切時所加的DNA溶液體積不能太大,，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應,。
2、酶活力通常用酶單位（U）表示,，酶單位的定義是：在zui適反應條件下,，1小時*降解1mg λDNA的酶量為一個單位，但是許多實驗制備的DNA不象λDNA那樣易于降解,，需適當增加酶的使用量,。反應液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外,，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應,。
3、市場銷售的酶一般濃度很大,，為節(jié)約起見,，使用時可事先用酶反應緩沖液（1×）進行稀釋。另外,，酶通常保存在50%的甘油中,，實驗中，應將反應液中甘油濃度控制在1/10之下,，否則,，酶活性將受影響。
37℃,2hr
終止反應 65℃ 10min
各取2ul酶解液,，電泳
EcoRI切割λDNA后電泳得到6個片段,
長度分別為 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb