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引物（primers）設(shè)計(jì)
點(diǎn)擊次數(shù)：1453 發(fā)布時(shí)間：2015-12-14
引物（primers)
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列,，
一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ),，
另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。
引物的重要性
在整個(gè)PCR體系中, 引物占有十分重要的地位,。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合,，不與其他非目的DNA結(jié)合,，PCR的靈敏性要求dna聚合酶能對引物進(jìn)行有效的延伸，可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān),。
引物設(shè)計(jì)原則
引物長度
一般為15-30個(gè)核苷酸,，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長的引物，但zui多不超過50個(gè)核苷酸,。
堿基分布的均衡性
同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè)
GC含量一般40-60%
GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低,，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性
GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。
引物Tm值
一般要求：55℃-65℃,。
計(jì)算：
對于低于20個(gè)堿基的引物,，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算
對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學(xué)參數(shù),，從“zui近鄰位”的計(jì)算方式得到,，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件zui常用的計(jì)算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15
引物二級結(jié)構(gòu)
引物二聚體
盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3’端有有較多堿基互補(bǔ)
發(fā)夾結(jié)構(gòu)
尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸,。
引物3’端
引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對,，不能進(jìn)行任何修飾,，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增*失敗,?？紤]到密碼子的簡并性，引物3’端zui后一個(gè)堿基不與密碼子第三個(gè)堿基配對,。