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DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析
點(diǎn)擊次數(shù)：1584 發(fā)布時(shí)間：2015-12-9
限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA,。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在,。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離,。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識別序列,。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ),。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個(gè)核苷酸序列:5"- G↓AATTC-3"),有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列,。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5"-CCC↓GGG-3");有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。
5"…G↓AATTC…3" →5"… G AATTC…3"
3"…CTTAA↑G …5" →3"… CTTAA G…5"
DNA純度,、緩沖液,、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響,。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí),會影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭,。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的zui適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解,。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解,。也可在*個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提,，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇,，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心,、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng),。
DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成,，以直線或環(huán)狀圖式表示,。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制,、DNA的無性繁殖,、基因文庫的構(gòu)建等工作中，建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是*的環(huán)節(jié),，近年來發(fā)展起來的RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上,。
構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法,。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對位置,。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和程度,。
在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜,，一般DNA用量約為0.5-1μg,。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)zui適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和zui適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對質(zhì)粒dna酶切反應(yīng)而言, 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶,消化1-2小時(shí),。但要*酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長,。