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自1985年英國遺傳學(xué)家Alec Jeffreys建立DNA指紋技術(shù)以來,，經(jīng)過近20年的發(fā)展,，法醫(yī)DNA分析先后已建立了DNA指紋技術(shù)，pcr擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析技術(shù),、線粒體DNA測(cè)序和DNA蕊片等主要技術(shù),，結(jié)合其它一些新的技術(shù)方法，如MVR-PCR,，PCR-SSO,，SSP-PCR、DHLPC,、TOMEF等,，共同形成了現(xiàn)代法醫(yī)DNA技術(shù),。隨著新的DNA遺傳標(biāo)記的不斷被發(fā)現(xiàn)，各種新的DNA分析,、分型技術(shù)方法的建立,，法醫(yī)DNA分析技術(shù)正朝著快速，準(zhǔn)確,，靈敏度和自動(dòng)化程度高的方向飛速發(fā)展,。 
1. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR),，是近年發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特 異DNA片段的技術(shù),。在1985年由Kary Mullis創(chuàng)立。此法操作簡便,，短時(shí)間內(nèi)在試管中可獲得數(shù)百萬個(gè)特異DNA序列的拷貝,。1993年Mullis因此獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。PCR技術(shù)已迅速滲透到分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,，在分子克隆,、遺傳病的基因診斷、法醫(yī)學(xué),、考古學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用,，而且與PCR相關(guān)的技術(shù)不斷被開發(fā)應(yīng)用。目前大多數(shù)法醫(yī)DNA分析技術(shù)均以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行分型,。 
PCR技術(shù)的原理 
PCR技術(shù)實(shí)際上是模擬生物體內(nèi)的在模板DNA,、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的體外DNA酶促合成反應(yīng),。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA 結(jié)合的特異性,，引物是PCR反應(yīng)中zui主要的成分。反應(yīng)分三步：(1)變性(denaturation)：首先是雙鏈DNA分子在95℃左右高溫下加熱,，dna雙螺旋配對(duì)堿基間的氫鍵斷裂,，雙鏈 解離成單鏈DNA；(2)退火(annealing)：降低溫度使引物和其互補(bǔ)的模板形成雜交鏈,。由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多,，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，模 板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少,； (3)延伸(extension)：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖 核苷酸底物及Mg2+存在的條件下,，聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的5′→3′方向的DNA鏈延伸反應(yīng)。 
經(jīng)過高溫變性,，低溫退火和中溫延伸3個(gè)溫度的循環(huán),，模板上介于兩個(gè)引物之間的序 列不斷得到擴(kuò)增。每循環(huán)一次,，目的DNA的拷貝數(shù)加倍,，隨著循環(huán)次數(shù)的增加,，目的 DNA以指數(shù)的形式堆積，數(shù)量可達(dá)2 ×105～7拷貝,。在反應(yīng)的zui初階段,，原來的DNA擔(dān)負(fù) 著起始模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增,，由引物引導(dǎo)延伸的片段急劇地增多而成為主要模板,。因此，絕大多數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物將受到所加引物5′末端的限制,，zui終擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5′端之間的dna片段,。 
在一個(gè)PCR體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因座的方法叫做復(fù)合擴(kuò)增（Multiplexing PCR）。復(fù)合擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系仍由反應(yīng)緩沖液,、dNTP,、引物、模板,、dna聚合酶及Mg2+組成，擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成和擴(kuò)增熱循環(huán)條件相同,，唯有引物是多對(duì),。復(fù)合擴(kuò)增提高單次檢測(cè)的信息量，克服了單位擴(kuò)增時(shí)必須分別加入引物,，分別擴(kuò)增,，分別電泳的缺點(diǎn)。同時(shí),，復(fù)合擴(kuò)增可以減少檢材用量,。目前，銀染系統(tǒng)和熒光標(biāo)記自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)多個(gè)基座時(shí),，通常都采用復(fù)合擴(kuò)增的方法,。 
PCR技術(shù)具有敏度高、特異性強(qiáng),、種屬特異性好,、適于降解DNA檢材、擴(kuò)增產(chǎn)物分析方法多樣化等特點(diǎn),，一些新的PCR相關(guān)技術(shù)在法醫(yī)DNA分析得到應(yīng)用.
2. PCR—RFLP技術(shù) 
PCR—RFLP是在RFLP分析方法的基礎(chǔ)上發(fā)展建立的一種更為簡便的DNA分型技術(shù),。PCR—RFLP的基本原理是用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段,，直接在凝膠電泳上分辨,。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶,。此項(xiàng)技術(shù)大大提高了目的DNA的含量和相對(duì)特異性,，而且方法簡便,，分型時(shí)間短。已廣泛應(yīng)用于AB0,、HLA,、線粒體DNA等序列多態(tài)性分析中。 
PCR—RFLP與DNA—RFLP分型方法相比,，雖有很大的改進(jìn),，但酶切條件要求較高， 受影響因素較多,，有時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能*被內(nèi)切酶消化切割,；有時(shí)區(qū)分所有的等位基因比較困難。 
3.PCR—SSO技術(shù) 
序列特異性寡核苷酸—聚合酶鏈反應(yīng)(Sequence Specific Oligonucleotide-PCR,，PCR- SSO)或等位基因特異寡核苷酸—聚合酶鏈反應(yīng)(Allelic Specific Oligonucleotide- PCR,，PCR-ASO)是利用合成與一種或多種等位基因特異堿基序列的互補(bǔ)寡核苷酸探針，并與特定片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在一定離子強(qiáng)度的雜交液和溫度下進(jìn)行雜交,，雜交完畢后進(jìn)行檢測(cè)判別有無結(jié)合,。檢測(cè)有堿基序列差異的特定等位基因多態(tài)性。其檢測(cè)可采用放射性同位素或熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng),。目前在國外多采用熒光標(biāo)記法。PCR—SSO是目前應(yīng)用zui多的一種簡單,、快速而又的HLA—Ι、Ⅱ類DNA分型方法,，能鑒定所有已知序列的HLA—A,、B、DR,、DQ,、DP等位基因，地分析DNA的多態(tài)性,。 
SSO方法的優(yōu)點(diǎn)是快速方便,，可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣本。缺點(diǎn)是探針檢測(cè)的位點(diǎn)有限,，某些未知的位點(diǎn)不能很好的被檢測(cè)出來,。 
雜交反應(yīng)是在固定有探針或擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交膜上進(jìn)行,， 如把擴(kuò)增產(chǎn)物先固定在膜上，用標(biāo)記好的已知序列的寡核苷酸探針去雜交檢測(cè)的稱“正向雜交”,。反之,，先將已知序列的寡核苷酸按順序固定在膜上,，在PCR擴(kuò)增過程中標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物或在擴(kuò)增后標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物,，用這種帶標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在膜上的寡核苷酸序列雜交來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列,，根據(jù)寡核苷酸在膜上固定的順序來確定待測(cè)等位基因的序列的方法,，稱“反向雜交”,。正向,、反向雜交技術(shù)各有特點(diǎn),，正向雜交更適合于大批量篩選，反向雜交對(duì)較小數(shù)量分析更能體現(xiàn)它的優(yōu)點(diǎn),，目前反向雜交應(yīng)用較廣,。 
PCR-ASO技術(shù)即把固相載體上固定的探針通過雜交檢測(cè)靶基因擴(kuò)增片斷。PCR-ASO技術(shù)主要分四步進(jìn)行：PCR擴(kuò)增,、雜交、顯示雜交信號(hào),、雜交結(jié)果的分析。在PCR緩沖液中加入大量DNTPs,，生物素標(biāo)記結(jié)合引物和耐熱穩(wěn)定性DNA多聚酶,，然后加入DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物用于擴(kuò)增DNA序列的特異位點(diǎn),。加熱后,，DNA螺旋的兩條帶分開（變性）,，引物的目的結(jié)合位點(diǎn)暴露。然后再降至某一特定溫度后,，引物將與其互補(bǔ)的序列相結(jié)合（退火），然后,，在另一個(gè)特定溫度下，熱穩(wěn)定性DNA聚合酶在大量DNTPs存在下沿著模板鏈擴(kuò)增延長退火后,，引物（延伸）以此方法一個(gè)循環(huán)后,，兩個(gè)生物素標(biāo)記了的目的序列產(chǎn)生,。經(jīng)過多次循環(huán),，大量的生物素標(biāo)記的目的基因序列產(chǎn)生擴(kuò)增后的生物素酰化DNA樣品經(jīng)化學(xué)變性,，每條鏈與固定基試劑條上的等位基因線列特異性的寡核苷酸探針雜交。然后快速?zèng)_洗以去除所有錯(cuò)配的擴(kuò)增DNA,。沖洗后加入堿性磷酸酶結(jié)合的鏈親合素,，使之與生物素酰化的雜交產(chǎn)物結(jié)合,，然后再與包含染色劑的底物溶液一起孵育產(chǎn)生紫色/棕色沉淀,。沖洗以終止反應(yīng),，用探針的反應(yīng)格局表記錄結(jié)果,。