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限制性內(nèi)切酶的酶切
點擊次數(shù)：1441 發(fā)布時間：2015-11-23
【基本原理】
限制性內(nèi)切酶已有百余種,，每種酶有其特定的核苷酸序列識別特異性,，酶的活性需Mg+2來激活。不同的酶也有許多差別：有些酶除需Mg 2+外,，還需ATP等其他輔助因子的激活,；切割位點和識別序列間的距離不同；有的內(nèi)切酶同時具有甲基化作用,。根據(jù)這些差別,，可將限制性內(nèi)切酶分為I、II和III種類型,。
II型限制性內(nèi)切酶只需要二價鎂離子的激活,，酶在其識別序列內(nèi)切割雙鏈DNA，產(chǎn)生的各種dna片段具有相同的末端結(jié)構(gòu),，而且大多數(shù)的II型酶可提供粘性未端,，有利于片段再連接，大部分II型酶所識別的序列具有反向?qū)ΨQ的結(jié)構(gòu),，或稱之回文結(jié)構(gòu),。如 EcoRI和 HindIII的識別和切口分別為：
EcoRI ： G ↓AATT C HindIII ： A↓AGCT T
T TCGA↑ A C TTAA↑G
限制性內(nèi)切酶對環(huán)狀質(zhì)粒dna產(chǎn)生的酶切片段數(shù)與切口數(shù)一致。因此,，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù),，就可以推斷切口的數(shù)目；從片段遷移率可判斷酶切片段大小,。用已知分子量的線狀DNA為對照,，通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知DNA的相對分子大小,。
質(zhì)粒DNA的相對分子量（Mr ）一般在106～107 范圍內(nèi),，如質(zhì)粒pBR322的相對分子質(zhì)量為 2.8×106 ，在細胞內(nèi)有三種構(gòu)型：①共價閉環(huán) DNA,，常以超螺旋形式存在,；②如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,，這種松弛型的分子叫作開環(huán)DNA,；③雙鏈線狀DNA由于兩條鏈的切口在同一部位被切斷，不能成環(huán),，*開放成線狀,，簡稱線性DNA,。如果要測定質(zhì)粒DNA的相對分子量，把質(zhì)粒用單一切口的酶水解得到線性DNA片段,。三種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA在電泳時的泳動速度為：共價閉環(huán)DNA>線狀DNA >開環(huán)DNA,。
本實驗采用限制酶BamHI ，切割pUC18-KanR質(zhì)粒中插入的分子大小為1200 bp的KanR基因片段,。
【器材】
1．水浴箱
2．高壓滅菌鍋
【試劑】
1．10×限制酶緩沖液
2．限制酶BamH I
3．DNA樣品,，重組質(zhì)粒
【操作步驟】
1．在Ep管中分別加入以下試劑：
10×限制酶緩沖液 2μl
pUC18-KanR 2μl
ddH2O 15μl
BamH I 1μl
2．將上液混勻，37℃保溫,，1h,。
3．加入1μl 0.5mol/L EDTA（pH8.0）終止反應。
4．1% 瓊脂糖凝膠電泳,，檢測酶切結(jié)果,。
pUC18/pUC19 cloning site圖