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基因克隆策略與引物設(shè)計(jì)原則
點(diǎn)擊次數(shù)：2227 發(fā)布時(shí)間：2015-11-19
1 功能基因克隆的基本策略
① 根據(jù)已知的脊椎動(dòng)物某一特定基因的氨基酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,，利用RT-PCR技術(shù)獲得該基因的核心片斷,，將該片斷分離純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌,，挑取白色菌落,，經(jīng) PCR反應(yīng)鑒定得到陽性克隆，送陽性克隆的PCR產(chǎn)物去測(cè)序,，從而獲得目的基因的cDNA核心片斷的序列,。
② 利用3’-RACE 和5’-RACE 技術(shù)擴(kuò)增cDNA的3’末端和5’末端，將cDNA核心片斷,、3’末端和5’末端進(jìn)行序列拼接,，從而獲得全長(zhǎng)cDNA序列。
③ 通過基因組PCR獲得內(nèi)含子DNA序列,，通過基因組步移技術(shù)進(jìn)一步克隆該基因的5’側(cè)翼序列（含啟動(dòng)子及其它順式調(diào)控）和3’ 側(cè)翼序列,，從而獲得該基因的基因組DNA全序列。
2 引物設(shè)計(jì)基本原則
細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR 中zui重要的一步,。理想的引物只跟目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火,。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會(huì)擴(kuò)增出其他非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個(gè)可以增加特異性引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)：
① 典型的引物長(zhǎng)18-24bp,。引物足夠長(zhǎng),，保證序列特異性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性,。但是長(zhǎng)度大于24bp 的引物并不意味著更高的特異性,。較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤配對(duì)序列雜交，降低特異性,，而且比短序列雜交慢,，從而降低了產(chǎn)量,。
② 選擇GC 含量為40%-60%。高GC 含量導(dǎo)致形成穩(wěn)定的不正確的配對(duì),，而高AT 含量降低正確配對(duì)的Tm值,。
③ 設(shè)計(jì)5’端和中間區(qū)為G 或C的引物。這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性,。
④ 避免多堿基序列（如poly dG）或者重復(fù)結(jié)構(gòu)域的延伸——它們能夠在模板上進(jìn)行不正確的配對(duì),。
⑤ 避免在PCR反應(yīng)中使用與其它引物互補(bǔ)的序列，以阻止引物之間的配對(duì),，形成引物二聚體,，抑制擴(kuò)增。
⑥ 在引物5’末端加入限制性酶切位點(diǎn)序列時(shí),，一定要包含幾個(gè)額外的堿基（2-6堿基）作為固定,，以防止5’末端在消化時(shí)的移動(dòng)。