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士鋒生物轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測
點擊次數(shù)：1070 發(fā)布時間：2015-11-10
一 ,、材料,、試劑和儀器
1 材料 基因特異引物，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的基因組DNA,，含目的基因得質(zhì)粒
2 試劑 PCR Kit
3 儀器 PCR儀（PE2400）,，電泳儀，紫外照相裝置
二,、 操作程序
1. 在滅菌1.5mL管中25μl滅菌ddH2O,,，加入100ng-1μg轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的基因組DNA中，沸水浴5-10min,。取出立即置于冰上,，使基因組DNA變性充分。
2．在一滅菌的0.2mL小離心管中依次加入(總體積為25 ul)：
10×buffer 2.5μl
4×dNTPs （每種2.5mM ） 2.0μl
primer I (10pmol/μl) 0.5μl
primer II(10pmol/μl) 0.5μl
Template 19μl
Taq E 0.5μl (2U)
把加樣品的EP管稍離心后,，置冰上備用,，待 PCR儀溫度升至94℃時,，將管子插入，按Pause鍵暫停,，加入Taq E 0.5μl (2U)[此為熱啟動Hot start,可以防止非特異性擴(kuò)增 ],。其上機(jī)的循環(huán)條件為：94℃變性3min ，55℃退火30sec ,72℃延伸45sec ,，共進(jìn)行30個循環(huán),，然后72℃再延伸7min 以補(bǔ)平DNA末端。
3. 1%Agarose gel電泳檢測,，紫外照相,。
三、結(jié)果與分析
PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測在預(yù)計的分子量處出現(xiàn)單一DNA條帶,，但常常是一條帶有主帶的彌散帶,，這在以核基因組DNA做模板是常會出現(xiàn)，可能的原因是：核基因組復(fù)雜度高,，退火溫度低，延伸時間長,，引物和模板量大等,。解決的方法有：采用熱啟動（如本實驗），減少模板和引物量,，提高退火溫度甚至在68℃下退火和延伸,，降低退火和延伸時間，減少循環(huán)次數(shù),，改變Mg 2+濃度（1.5-8mmol/L）等,。
轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測
其中M: DL2000； (+)含目的基因得質(zhì)粒為模板,，作為陽性對照,；(-) 為野生型煙草基因組DNA模板作陰性對照；1-5：為轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA為模板,。結(jié)果表明3非轉(zhuǎn)基因煙草,，而1，2,，4,，5為陽性轉(zhuǎn)基因煙草。特異引物擴(kuò)增條帶長為750bp,。