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目的基因片段的回收
點(diǎn)擊次數(shù)：3349 發(fā)布時(shí)間：2015-11-3
6.1實(shí)驗(yàn)原理
dna片段的分離與回收是基因工程操作中一項(xiàng)重要的技術(shù),，如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制備探針，回收PCR產(chǎn)物用于再次鑒定等,。理想的DNA片段回收方法應(yīng)滿足以下幾個(gè)要求：
（1）回收片段應(yīng)有非常高的純度
如從普通凝膠中分離出來的片段不可帶有即使是微量的凝膠――凝膠會(huì)抑制大部分的酶活力,，對(duì)于后續(xù)DNA片段用于再酶切分析或連接均是不利的。
（2）回收過程必須是嚴(yán)格的無dna酶污染的操作過程
衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解,，當(dāng)降解作用僅發(fā)生在粘性末端時(shí),，在凝膠電泳中是無法看到回收的DNA片段有任何差異，但會(huì)導(dǎo)致DNA連接實(shí)驗(yàn)的失敗,，zui終影響后續(xù)的克隆實(shí)驗(yàn),。
（3）能回收不同大小的DNA片段
對(duì)于采用的回收方法必須能對(duì)不同大小的DNA片段均能回收，當(dāng)回收大片段時(shí)不發(fā)生機(jī)械性損傷與斷裂作用,，造成大片段斷裂,。
（4）回收效率要高
回收方法要能對(duì)微量DNA也能進(jìn)行操作,，也即回收效率相對(duì)要較高，則對(duì)于實(shí)驗(yàn)中獲得的非常微量的DNA樣品也可進(jìn)行分析,。
（5）操作簡單、快速
在回收過程中一般不需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,，也不需要昂貴的試劑,，并且操作時(shí)間較短，象現(xiàn)在常用的試劑盒回收在電泳完成后整個(gè)回收過程只需30min左右,，并且樣品的回收率可達(dá)50％,。
6.1.1各類常用回收方法
由于分離方法眾多，且各種不同的方法可能同時(shí)依據(jù)多項(xiàng)原理,，所以只能粗略地將各種方法分成五大類：電泳法,、收集孔法、機(jī)械破碎法,、溶（熔）膠法與酶處理法：
一,、電泳法
根據(jù)凝膠割否分透析袋法與流動(dòng)電洗脫法（割膠），濾紙-透析膜法與DEAE膜法（不割膠）,。
（1）透析袋法
該方法可回收大于5kb的片段,，缺點(diǎn)是操作麻煩并易造成DNA酶的污染。
（2）流動(dòng)電洗脫法
該方法回收片段大小為4～50kb,，且回收效率高達(dá)94～100％,，條件下可回收大至550kb的片段。缺點(diǎn)是操作繁瑣,，而且為了取得較高的回收率,，需特定的流動(dòng)電洗脫槽。
（3）濾紙-透析膜法
回收率平均達(dá)70％左右,，不需割膠,，操作相對(duì)簡單，但實(shí)驗(yàn)中需將濾紙上的DNA洗脫,，也較繁瑣,，也不易控制。
（4）濾紙-透析膜法
此方法用于回收小片段,，一般小于5kb的片段回收效率較高,，可達(dá)70％以上；對(duì)于大片段（>15kb）則難以從DEAE膜上洗脫下,。
二,、收集孔法
（1）蔗糖法
回收小片段效率較高，564bp的PCR產(chǎn)物帶回收效率高達(dá)97.6%,，并且回收中能將較寬的條帶濃縮于收集孔中,，但回收中制作收集孔較麻煩,，并且收集孔中要加入蔗糖，故獲得的DNA樣品不能直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。
（2）羥基磷灰石法
該方法回收效率也較高,，不利之處與上述方法相同，獲得的DNA需再純化,，操作也較繁瑣,。
三、機(jī)械破碎法
指用機(jī)械力將凝膠壓碎后再行回收DNA片段,，有凍擠法,，凍融法、壓碎浸泡法,、（單層）濾膜過濾法及雙層（親和）膜過濾法,。
（1）凍擠法
將膠條割下置于塞有玻璃棉的吸嘴或是管底刺有小孔的eppendorf管中，冰凍30min后全速離心5min,，收集清液,，再經(jīng)酚抽提、乙醇沉淀等純化濃縮處理（也可直接沉淀）,。其基本原理理是利用離心力將凝膠中原有的液體擠出,，同時(shí)也帶出膠中的DNA。從膠濃度為1%瓊脂糖中回收650bp,、1.1kb,、2.0kb、4.5kb的片段時(shí),，回收率分別為90％,、74％、56％,、30％,。這是因?yàn)榇蠓肿覦NA更難于被膠中的緩沖液帶出，所以此法只適用于回收較小的DNA片段,。
（2）凍融法
割下的膠條放在eppendorf管中,，將之搗碎并放于-80℃冰凍5min，取出后迅速放置于37℃保溫10min,，如此反復(fù)3次能使DNA從膠中游離出來,，離心獲得上清中即含有目的DNA，可通過沉淀濃縮獲得高濃度,。對(duì)一般的DNA片段回收效率在60～80%,。操作簡單,，并不需特殊設(shè)備,。
（3）壓碎浸泡法
又稱醋酸銨法，操作較費(fèi)時(shí),，回收效率較低，一般改良的方法是在凍擠法操作中,，加入一定的水并浸泡10min,，增加DNA的回收率。