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士鋒細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：942 發(fā)布時(shí)間：2015-9-9
．實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
1．以pGLO質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌為例,，學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)化的基本原理及方法。
2．驗(yàn)證DNA是遺傳物質(zhì),，加深對(duì)中心法則的理解,。
二．實(shí)驗(yàn)原理
轉(zhuǎn)化（transformation）是指一段同源或異源的DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并得到表達(dá)的水平基因的轉(zhuǎn)移過程，是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究和基因工程*的重要技術(shù),。目前常用的轉(zhuǎn)化方法有CaCl2法(化學(xué)轉(zhuǎn)化法)和電轉(zhuǎn)化法。本實(shí)驗(yàn)是用pGLO細(xì)菌轉(zhuǎn)化試劑盒中提供的pGLO質(zhì)粒來轉(zhuǎn)化大腸桿菌,，所用方法為CaCl2轉(zhuǎn)化法,。
pGLO質(zhì)粒： 細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
pGLO質(zhì)粒上主要含有兩個(gè)基因,，一個(gè)為編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因，一個(gè)為抗生素氨芐青霉素抗性基因,。此外,，該質(zhì)粒還整合有一個(gè)特殊的參與受體細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)的基因調(diào)控體系，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的綠色熒光蛋白基因只有在培養(yǎng)基中存在阿拉伯糖時(shí)才能啟動(dòng)表達(dá),。轉(zhuǎn)化子細(xì)胞將在不含阿拉伯糖的培養(yǎng)基上呈白色而在含阿拉伯糖的培養(yǎng)基上顯綠色熒光，這種熒光在長(zhǎng)波紫外燈下即可觀察到,。
三．實(shí)驗(yàn)材料
受體菌：E.coli K12 HB101
質(zhì)粒：pGLO plasmid
轉(zhuǎn)化液（CaCl2）
氨芐青霉素（amp）
阿拉伯糖（ara）
培養(yǎng)基：固體LB,、液體LB
細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)接種環(huán)、移液器等
四．實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備平板： 每組：1塊LB平板,，2塊LB/amp平板,，1塊LB/amp/ara平板
2. 準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞：用250μl無菌水或轉(zhuǎn)化液懸浮試劑盒中提供的大腸桿菌菌粉,，此即感受態(tài)細(xì)胞,。
3. 活化受體細(xì)胞：挑取1環(huán)E.coli K12 HB101菌液,，于LB培養(yǎng)基上37℃活化16-24h。
4. 轉(zhuǎn)化：
1）在兩只無菌離心管上分別標(biāo)
記+DNA, -DNA,。
2）在上述兩管中分別加入
250μl轉(zhuǎn)化液,。
3) 迅速置于冰上。
4）各挑取活化好的受體菌的一
個(gè)單菌落,，懸浮于兩管轉(zhuǎn)化液中,。
5）在標(biāo)有+DNA的管中加入一
環(huán)質(zhì)粒DNA,，而標(biāo)有-DNA的管中不加,。
6）將上述兩管于冰上放置10min。
7）在準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基底部如左圖,。