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士鋒PCR問(wèn)題的總結(jié)
點(diǎn)擊次數(shù)：958 發(fā)布時(shí)間：2015-8-20
PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間
一般為48h以?xún)?nèi),，有些于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失,。
假陰性,，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
pcr反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性,，③酶的質(zhì)量及,， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究,。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì),，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消 化除凈,，特別是染色體中的組蛋白,，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚,。⑤模 板核酸變性不*,。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處 理,，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改,。
酶失活：需更換新酶,，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性,。需注意的是有時(shí)忘加taq酶或溴乙錠,。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng),，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見(jiàn)原因,。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低,，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增,，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,，如一條引物有條帶,，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗,，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高，一條亮度低,，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度,。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分,，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效,。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠,，引物之間形成二聚體等,。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)pcr擴(kuò)增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶,。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul,、50ul,。或100ul,，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí),，一定要模索條件,，否則容易失敗。
物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要,，如變性溫度低，變性時(shí)間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過(guò)低,，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一,。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的,。