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士鋒PCR技術：PCR產物測序
點擊次數：926 發(fā)布時間：2015-8-5
PCR技術代替了為測序而反復進行的分子克隆和模板制備步驟。PCR技術與自動測 序技術相結合后,，它將成為一種zui快,、zui有效的測定核苷權序列的方法。本章主要綜 述各種測模板的制備以及如何完成PCR產物的直接測序,。與傳統(tǒng)的將PCR片段克隆入質 ?；虿《净蚪M相比，直接序列分析有兩個主要的優(yōu)點:1)由于它是一個不依賴于生 物體(如細菌,、病毒等)的體外系統(tǒng),，因而它更容易標準化(即例于自化2);對于每個待 測樣品，只需測定一個單鏈序列，因而它也就更快和更準確,。相比之下,，間接測序為 了區(qū)別在PCR反應過程中由dna聚合酶引入的隨機錯朽核苷酸所引起的原始基因組序列 中的突變，以及由體外重組而產生的人工擴增產物,，如產生鑲嵌等位基因(混合克隆) 等,，每個樣品不得不測定幾個PCR產物克隆的序列,。
不需借助在細菌中克隆就可直接獲得清蜥和準確的序列結果,，其難易程度取決 于:1)只擴增靶序列的PCR引物的擴增能力(通常稱為PCR特異性);2用以獲笪測序模板 的方法。與引物物異性及模板制備有關的問題將在下面談到,。雖然DNA測序的化學法 (Maxam-Gilbrt)可以用來直接測序,，但我們這里僅討論Sanger的末端終止法。
*的PCR條件
PCR反應的特異性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所決定的,。對于特定 的引物組,，PCR的特異性可以由于采用*的反應條件、退火溫度和PCR緩沖液中的 MgCl2濃度而發(fā)生明顯的變化,。如果用標準的1.5mM的MgCl2濃度不能得到所需的特異 性PCR產物,，我們建議MgCl2的終濃度為1.4∽2.5mM之間，以0.2mM增長率來改變MgCl2 濃度,，以選擇*Mg++濃度,。一個較常遇見的問題是，使PCR特異性達到zui高的MgCl2 濃度導致pcr擴增失敗(dropouts),。這可能是由于模板DNA溶液中有較高的EDTA,，它隆 低了提供給Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此,，對于擴增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA,， 我們建議用含2.0mM的MgCl2的PCR緩沖液。
pcr反應的溫度范圍包含有三個不同的恒定期:變性期,、退火期和延伸期,，還有它 們之間的過渡期。為了獲得用于序列分析的模板或雜交探針的單鏈DNA,，通常并不需 要改變參數,。
凝膠純化PCR擴增的靶序列
如果*PCR反應條件不能產生所需的特異性產物，可采用新的寡核苷酸重新進 行擴增,，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產物,，而后再各自重新擴增進行序列分析。 長度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:
1.片段大小在80-100bp時,，可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來 分離,。
2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。
3.加入50∽100μlTE浸泡膠片,，可反復凍融或放置幾個小時使DNA從膠中擴散出 來,。
4.取少量(1-5%)進行第二次擴增,，為得到純凈單一的產物，用于第二次PCR擴增 的凝膠抽提物的量必須少于1ng,。
5.現已發(fā)現瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質,。因而，如需重新擴增供Tab聚合 酶測序用的片段,，用丙烯酰胺電泳分離,。
當用PCR引物擴增幾個同樣長度的相關序列時，如來自幾個新近復制的基因,，或 重復序列或保守的信號序列(conserved signal sequences)的同樣顯子,，可以通過下 列兩種不同方法來改進電泳分離。1).先用只切割某一模板的內切酶進行酶切,，而后 電泳純化完整的PCR產物,。2).用可使核苷酸序列不同的擴增產物分開的電泳系統(tǒng)。下 一個部份將討論此類系統(tǒng)中的變性甲酰胺梯度凝膠系統(tǒng),。采用方法一時,，必須事先了 解在不同PCR產物中的內切酶位點。