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士鋒蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗
點擊次數(shù)：839 發(fā)布時間：2015-7-7
[原理]
蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下,，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開,，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物,，該復(fù)合物帶負電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移,，且主要由于凝膠的分子篩作用,，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān)，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽,。
聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng),，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液,，其pH值和離子強度也相應(yīng)不同,，故電泳時，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動的界面移動,，在分離膠表面形成了一個極薄的層面,，大大濃縮了樣品的體積,，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應(yīng)。
[試劑]
1,、30%凝膠貯備液：稱取29g 丙烯酰胺（Acr）和1g 甲叉-雙丙烯酰胺（Bis）,，加蒸餾水至100ml，濾紙過濾貯存,。
2,、10% SDS：稱取SDS 10g 加蒸餾水至100ml。
3,、10%過硫酸胺（AP）
4,、N，N,，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）
5,、5×電泳緩沖液：于900ml蒸餾水中分別加入15.1g Tris,、94g甘氨酸、5g SDS,，混勻后加蒸餾水至1 000ml,。
6、1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)和1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)
7,、電泳加樣緩沖液
10mmol/LpH6.8 Tris
200mmol/LDTT
4%SDS
0.2% 溴酚蘭
20% 甘油
8.正丁醇
[器材]
1,、移液器
2、移液管
3,、燒杯
4,、垂直電泳槽
5、電泳儀
[操作步驟]
1.配制分離膠濃度8%,、體積15ml
H2O 6.9ml
30%凝膠貯備液 4.0ml
1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) 3.8ml
10%SDS 0.15ml
10%過硫酸胺 0.15ml
TEMED 0.01ml
2.一旦加入TEMED,，混勻后立即小心地將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，為成層膠留有足夠空間,。用毛細管輕輕在其頂層加入幾毫升正丁醇,，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。
3.聚合完成之后,，倒掉覆蓋液體,，用去離子水洗凝膠上部數(shù)次，盡可能用吸水紙吸干頂端的殘存液體,。
4.配制5%成層膠5ml,，插入梳子，小心避免混入氣泡,，垂直放置室溫下,。
H2O 3.4ml
30%凝膠貯備液 0.83ml
1.0mol/Ltris-HCl(pH6.8) 0.63ml
10%SDS 0.05ml
10%過硫酸胺 0.05ml
TEMED 0.01ml
5.在成層膠聚合時,，將樣品與加樣緩沖液混勻，100℃加熱3min,。
6.成層膠聚合完成后,，用去離子水沖洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，將凝膠放入電泳槽上,。
7.加樣
8.電泳：開始時電壓為8V/cm凝膠,，染料進入分離膠后，將電壓增加到15V/cm凝膠,，繼續(xù)電泳直到染料抵達分離膠底部,，斷開電源。
9.取下凝膠,，固定,、染色或進行Western blot分析。