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水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA
點(diǎn)擊次數(shù)：1588 發(fā)布時(shí)間：2015-6-9
實(shí)驗(yàn)原理
閉合環(huán)狀質(zhì)粒,、線性質(zhì)粒和開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA由于構(gòu)形不同，在加溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)不同的遷移率,，因而在紫外燈下觀察,，能區(qū)別閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（cccDNA）、線性質(zhì)粒DNA（L-DNA）和開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA（ocDNA）,。
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 選擇合適的水平式電泳槽,，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平。檢查穩(wěn)壓電源與正負(fù)極的線路,。
2. 選擇孔徑大小合適的點(diǎn)樣梳子,，垂直架在電泳膠模的一端，使點(diǎn)樣梳子底部離電泳膠模底部的距離為1.0 mm,。
3. 制備0.7%瓊脂糖凝膠,，100℃水浴加熱至瓊脂糖融化均勻。
4. 用吸管取少量瓊脂糖凝膠溶液將電泳膠模四周密封好,，防止?jié)补喹傊悄z板時(shí)發(fā)生滲透,。待瓊脂糖凝膠冷卻至60℃左右時(shí)，加入一滴溴化乙錠,，搖勻,，輕輕倒入電泳膠模中，瓊脂糖凝膠的厚度在3~5 mm,。倒膠時(shí)要避免產(chǎn)生氣泡,，若有氣泡可用吸管小心吸去。
5. 瓊脂糖凝膠凝固后,，在室溫放置20分鐘,，小心拔掉點(diǎn)樣梳子和電泳膠模兩端的擋板，保持點(diǎn)樣孔的完好,。
6. 將電泳膠模放入電泳槽中,，加入電泳緩沖液，使電泳緩沖液面高出瓊脂糖凝膠表面1~2 mm,。如點(diǎn)樣孔內(nèi)有氣泡,，用吸管小心吸出，以免影響加樣。
7. 將15mlDNA樣品與1/5體積的溴酚藍(lán)指示劑點(diǎn)樣緩沖液混合,。上樣緩沖液不僅可以提高樣品的密度,，使樣品均勻沉到樣品孔內(nèi)，還可以使樣品帶顏色,，便于上樣和估計(jì)電泳時(shí)間和判斷電泳的位置,。
8. 用微量移液器將樣品小心加入加樣孔內(nèi)，記錄樣品點(diǎn)樣秩序,。
9. 蓋上電泳槽,，開(kāi)啟電源開(kāi)關(guān)，zui高電壓不超過(guò)5 V/cm（100~150 V恒壓電泳）,，使DNA從負(fù)極向正極移動(dòng),。
10. 電泳時(shí)間隨實(shí)驗(yàn)的具體要求而異。電泳一般需1~3小時(shí),。電泳完畢后關(guān)閉電源,，戴一次性塑料手套取出凝膠，盡可能將所有的電泳緩沖液淋干,，在254 nm 波長(zhǎng)的透射紫外燈下觀察,。
提示
一、瓊脂糖凝膠電泳
1. 瓊脂糖凝膠的性質(zhì)
瓊脂糖是從海藻中提取的一種直鏈多糖,，它由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖的殘基交替排列組成的線型多聚糖,。當(dāng)瓊脂糖加熱至90～100℃左右，即可形成清亮透明的液體,。澆在模板上冷卻至40～45℃時(shí)，凝固形成凝膠,。瓊脂糖帶有親水性,，不含有帶電荷的基團(tuán)，不引起DNA變性,，又不吸附被分離的物質(zhì),，因此它是一種很好的凝膠劑。瓊脂糖凝膠可區(qū)分相差100bp的DNA片段,。
2. DNA分子的遷移率
DNA分子在電泳中的遷移率的因素是多方面的,，除了決定于DNA分子大小與構(gòu)型外，還有瓊脂糖凝膠的濃度,、電壓大小,、緩沖液pH值和電泳時(shí)的溫度等。
二,、實(shí)驗(yàn)操作中注意的問(wèn)題
1. 加熱溶解瓊脂糖時(shí)應(yīng)不斷地?fù)u動(dòng)容器,，使附于壁上的顆粒也*溶解。
2. 溴化乙錠是一種強(qiáng)致癌劑，并有中度毒性,，因此必須十分謹(jǐn)慎小心,。操作時(shí)一定要戴手套，用過(guò)的手套要及時(shí)將手套順手翻過(guò)來(lái),，讓污染有溴化乙錠的面朝里,。
3. 用254 nm 波長(zhǎng)的紫外光進(jìn)行觀察的效果比366 nm 清晰，但產(chǎn)生的切口DNA量也較高,。紫外光對(duì)眼睛有害,，觀察時(shí)應(yīng)戴上眼鏡或防護(hù)面罩。
編輯： 趙棟2012