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瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA
點(diǎn)擊次數(shù)：1427 發(fā)布時(shí)間：2015-5-19
目的： 學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳,，檢測質(zhì)粒DNA的構(gòu)型、分子量的大小,。
原理： 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，可作為電泳支持物,，適用于分離大小范圍在0.2-50kb的DNA片段,。DNA分子的遷移率與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。觀察其遷移距離,，與標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行對照,，就可獲知該樣品分子量大小。在質(zhì)粒抽提過程中,，由于各種因素的影響,，使質(zhì)粒DNA呈現(xiàn)超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀、開環(huán)狀分子,、線狀分子三種不同的構(gòu)型,，這三種分子有不同的遷移率。在一般情況下,，超螺旋型遷移速度zui快,，其次為線狀分子，zui慢的為開環(huán)狀分子,。用熒光染料溴化乙錠（ethidium bromide, EB ）進(jìn)行檢測,，溴化乙錠嵌入堿基對之間形成熒光絡(luò)合物，在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光,。
儀器與主要試劑：
儀器：
1) 電泳儀
2) 水平電泳槽
3) 紫外檢測儀
主要試劑：
1) 提取的質(zhì)粒DNA
2) 5×TBE：54gTris; 27.5g硼酸; EDTA (0.5mol/l, pH 8.0) 20ml, 加水至1l,，用前稀釋10倍
3) 溴化乙錠（EB）：10mg/ml溶液
4) 溴酚藍(lán)
實(shí)驗(yàn)方法：
1) 稱取1g瓊脂糖于100ml 0.5×TBE中，加熱溶解,，冷卻至65℃左右再加入終濃度為0.5%-1.0%的EB,。
2) 電泳膠模兩端用透明膠帶封固，梳子至于適當(dāng)位置,，將冷卻至65℃左右的瓊脂糖溶液慢慢倒在膠模上,，厚度約3㎜。靜置,，待膠凝固后揭去膠模兩端的透明膠帶,，放入電泳槽內(nèi),，倒入適量電泳緩沖液（一般液面高出凝膠1㎝），小心拔出梳子,。
3) 將5μg提取的質(zhì)粒DNA樣品,，與等體積溴酚藍(lán)指示劑混勻，加入凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi),，防止產(chǎn)生氣泡和樣品溢出,。
4) 將電泳槽通電，80V恒壓電泳30分鐘,。
5) 電泳完畢,，關(guān)掉電泳儀，倒去電泳槽中的電泳緩沖液,，小心取出凝膠置于紫外燈下觀察結(jié)果,，質(zhì)粒DNA條帶發(fā)出紅色熒光。
注意事項(xiàng)：
1) 防止紫外線對人皮膚及眼睛的損傷,，避免直接照射皮膚與眼睛,。
2) EB是強(qiáng)誘變劑，有致癌性,，操作時(shí)要帶手套,，防止污染。所有含有EB的溶液在棄置前應(yīng)當(dāng)進(jìn)行凈化處理,。