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考馬斯亮蘭法（Bradford法）測定蛋白濃度
點擊次數(shù)：1339 發(fā)布時間：2015-4-24
(一)實驗原理
雙縮脲法(Biuret法)和Folin?酚試劑法(Lowry法)的明顯缺點和許多限制,，促使科學家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。
1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法(Bradford法),，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的,。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點,，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度zui高的蛋白質(zhì)測定法,。
考馬斯亮蘭G-250染料,，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的zui大吸收峰的位置(lmax),，由465nm變?yōu)?95nm,，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色,。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合,。
在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595,，與蛋白質(zhì)濃度成正比,。
Bradford法的突出優(yōu)點是:
(1)靈敏度高,，據(jù)估計比Lowry法約高四倍,，其zui低蛋白質(zhì)檢測量可達1mg,。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復合物有更高的消光系數(shù),，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多,。
(2)測定快速、簡便,，只需加一種試劑,。完成一個樣品的測定,，只需要5分鐘左右,。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程,，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間,，顏色的穩(wěn)定性,。因而*不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間,。
(3)干擾物質(zhì)少,。如干擾Lowry法的K+,、Na+,、Mg2+離子,、Tris緩沖液,、糖和蔗糖、甘油,、巰基乙醇,、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點是:
(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差,，在制作 標準曲線時通常選用 g?球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差,。
(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定,，主要的干擾物質(zhì)有:去污劑,、Triton X-100,、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH,。(如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣)。
(3)標準曲線也有輕微的非線性,，因而不能用Beer定律進行計算,，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。
(二)試劑與器材
1.試劑:
(1)標準蛋白質(zhì)溶液,，用 g?球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液,。
(2)考馬斯亮蘭G-250染料試劑:稱100mg考馬斯亮蘭G-250,，溶于50ml 95%的乙醇后,，再加入120ml 85%的磷酸,，用水稀釋至1升。
2.器材:
(1)可見光分光光度計 (2)旋渦混合器 (3)試管16支
(三)操作方法
1.標準方法
(1)取16支試管,，1支作空白,，3支留作未知樣品,，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品,、水和試劑，即用1.0mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入:0,、0.01、0.02,、0.04,、0.06、0.08,、0.1ml,，然后用無離子水補充到0.1ml,。zui后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭G-250試劑,，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈,，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除),。未知樣品的加樣量見下表中的第8,、9、10管,。
(2)加完試劑2~5分鐘后，即可開始用比色皿,，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對照為第1號試管,，即0.1mlH2O加5.0mlG-250試劑。
注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),，可用塑料或玻璃比色皿,，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗,，以洗去染色,。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡,。
(3)用標準蛋白質(zhì)量(mg)為橫座標，用吸光度值A(chǔ)595為縱座標,，作圖,，即得到一條標準曲線。由此標準曲線,，根據(jù)測出的未知樣品的A595值,，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。
0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.50,。
2.微量法
當樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(10-100mg/ml),，可將取樣量(包括補加的水)加大到0.5ml或1.0ml，空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O,，考馬斯亮藍G-250試劑仍加5.0ml,，同時作相應(yīng)的標準曲線,，測定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595約為0.29,。