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體內體外表達
點擊次數：1099 發(fā)布時間：2015-3-25
作為分子生物學領域老牌廠家,，Promega同樣有很有特色的原核表達系統(tǒng),，不過縱觀Promega近年的表現，似乎不滿足于此,，而是將目光投向了跨物種間的穿梭表達,，以及越來越熱的體外表達系統(tǒng)了。
蛋白純化,，永遠是蛋白表達后zui令人關注的問題,。Promega的 PinPoint? Xa 表達系統(tǒng)則是巧妙利用了生物素作為親和純化的中介――將目的基因克隆到表達載體上的一段“神秘"多肽的DNA序列后面，這段‘神秘’多肽表達后在細胞體內會自然被生物素修飾,，所以大腸桿菌表達出的融合蛋白就是已經被生物素標記了的融合蛋白――生物素化的融合蛋白可以在直接上親和素純化柱,，進行高度專一的親和純化，zui后用生物素就可以在非變性條件下洗脫產物――zui后還需要Xa因子蛋白酶切將目標蛋白釋放出來,。這個系統(tǒng)利用“神秘"多肽自動在體內“生物素化",，不單方便產物檢測、親和純化,，而且得到的產物很多是可溶的,，加上后繼的親和純化條件溫和，有助于得到活性的蛋白質,。鏈霉親和素堿性磷酸酶可直接通過“簡化Western"的方法檢測帶生物素標簽的融合蛋白質,。
這個系列含有三個載體,，無論你想從哪里插入都有合適的表達框架。同時還含有一個專門作為對照的control載體,。它含有氯素酶轉乙?；福–AT）基因，作為監(jiān)控蛋白表達,、純化和加工條件的手段,。載體都是利用tac啟動子，它由lac啟動子的-10區(qū)和trp啟動子-35區(qū)融合而成,，匯合了lac和trp兩者優(yōu)點,，是一個很強的啟動子，同樣受LacI阻遏蛋白調控,。產量據說通?？梢赃_到1―5mg/L。用SoftLink?抗生物素蛋白親和純化樹脂是技術,，可將蛋白質以非變性形式洗脫出來,。或者也可以利用TetraLink? 四聯抗生物素蛋白樹脂對蛋白進行純化,。PinPoint 載體的特點是含有編碼內源蛋白酶因子Xa(發(fā)音為ten a)的蛋白水解位點，使得純化標簽可從天然蛋白上分離,。載體還帶有方便得多克隆區(qū)域,，便于構建融合蛋白。整個表達系統(tǒng)不過4000人民幣,，已經包含載體菌株檢測試劑純化柱和洗脫試劑等等,，一如Promega產品的實惠價格。
多系統(tǒng)表達,，東邊不亮西邊亮
Flexi? 載體系統(tǒng)是一種用于定向克隆蛋白編碼序列的,、簡單而功能強大的方法。它是以兩種稀有的限制性內切酶：Sgf I 和 Pme I為基礎,。這兩種酶在我們試驗常用到的物種：人,、大鼠、小鼠,、線蟲等中出現頻率都非常小,，一般情況都在5%一下。該系統(tǒng)提供快速,、有效和保真度高的方法,，在多種Flexi? 載體之間轉移蛋白編碼區(qū)，而無需重新測序,。這一由酶和相關載體組成的系統(tǒng),，使得客戶可以很方便地將設計的開放讀碼框架（ORFs）進行克隆,，并可以根據不同的應用目的而使其在不同種類的載體之間轉移。多系統(tǒng)表達載體除了Promega的這種之外,，還有Invitrogen的Gateway技術和Qiagen的pQE-TriSytem載體,。Invitrogen的Gateway技術有其桿裝病毒和酵母表達系統(tǒng)的成功顯得底氣十足，但是它有個麻煩的地方,，就是要先做入門載體,，之后每次再進行位點專一重組轉入表達載體。Qiagen是一個載體通殺,，給它加上大腸桿菌,、桿裝病毒和哺乳動物的啟動子，這么看來Qiagen好像是zui方便的,，但是原核和真核的RNA聚合酶識別序列畢竟是不同的,，對其表達的效率存在一定質疑。
Promega的多系統(tǒng)表達有個突出的地方是它不單有普通原核表達,、融合原核表達,、哺乳動物表達，它還有體外表達,。從哺乳動物細胞中提取的或通過克隆化DNA在體外轉錄產生的mRNA,，在無細胞提取液中能被翻譯而合成蛋白質，這些蛋白質可用于免疫沉淀實驗或進行生物活性測定,。一般用來進行體外表達的有兔網織紅細胞裂解液和麥胚提取物兩種,，這里有專門利用麥胚提取物的載體。
Promega不需要構建入門載體,，你在眾多載體中先選擇一個zui有希望的就可以先進行表達了,。載體的構建過程是經典的酶切、連接過程,，利用Promega提供的酶混合溶液（SgfⅠ和PmeⅠ）在37℃溫育半個小時,，65℃使失活20分鐘。將PCR產物純化后與酶切后的載體室溫連接1小時,，可以發(fā)現Promega的酶切和連接相對傳統(tǒng)的方法需時較短,。由于載體本身在SgfⅠ與PmeⅠ酶切位點之間是一個致死基因，這樣使得到陽性克隆的幾率大大加大了,。但是隨之而來的問題是,，這種載體的儲存問題。普通的載體我們可以儲存在大腸桿菌中,，不斷復制,，不斷繁殖，一次購買以后可以省下很多錢,。但是載體上有致死基因就只能每次都向廠家購買了,。
好,，現在你把重組質粒構建成功，轉入含有DE3片段的大腸桿菌中,，利用IPTG進行誘導,，發(fā)現無法表達，或者表達后想利用其它載體也進行表達以進行比較,。那么你可以將外源片段轉移到其它載體上,，Flexi?系統(tǒng)擁有以下幾個載體：
Flexi? 載體名稱 | 應用 | 表達啟動子 | 抗性 | 融合多肽 | ||
大腸桿菌 | 哺乳動物細胞 | 體外轉錄 / 翻譯 | N 末端 | |||
pF1A T7 Flexi? Vector | 表達 | T7 | T7 | 氨芐青霉素 | ||
pF1K T7 Flexi? Vector | 表達 | T7 | T7 | 卡那霉素 | ||
pFN2A (GST) Flexi? Vector | 表達與純化 | T7 | T7 | 氨芐青霉素 | GST | |
pFN2K (GST) Flexi? Vector | 表達與純化 | T7 | T7 | 卡那霉素 | GST | |
pF3A WG (BYDV) Flexi? Vector | 體外麥芽表達 | T7, SP6 | 氨芐青霉素 | |||
pF3K WG (BYDV) Flexi? Vector | 體外麥芽表達 | T7, SP6 | 卡那霉素 | |||