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技術(shù)文章
堿性磷酸酶偶氮―偶聯(lián) 法
點擊次數(shù)：1261 發(fā)布時間：2015-3-3
人工合成的磷酸萘酚鹽經(jīng)堿性磷酸酶 水解后釋放出萘酚,，后者立即與重氮鹽偶聯(lián)生成不溶性偶氮色素,。
1)孵育液配制
萘酚AS(或萘酚AS-MX) 10―25rug
N,，N―二甲基甲酰胺液 0．5ml
0．2mol／LTris鹽酸緩沖液(pH 8．2―9．2) 50ml
堅牢藍(lán)B(或BB、RR,，或堅牢紅TR,、堅牢藍(lán)VRT) 50mg
混合、攪拌及過濾,，必要時可使用氫氧化鈉調(diào)整pH,。
2)操作程序：
①新鮮組織冰凍切片：
②人孵育液，37C(或室溫下)孵育5―60分鐘,；
③雙蒸水洗3～5分鐘,；
④4％甲醛，室溫下固定10～15分鐘,；
⑤蒸餾水洗3～5分鐘,；
⑥甘油明膠封固。
3)結(jié)果與評價：采用不同的重氮鹽,。酶的活性顯色也不同,，用堅牢藍(lán)B(或BB、RR)酶活性呈藍(lán)紫色,，用堅牢紅TR(或堅牢紫B)酶活性呈紅色,。萘酚法有三個優(yōu)點：
①反應(yīng)產(chǎn)物溶解度小。局部比較明顯,；
②萘酚化合物能較快地被水解,，可縮短孵育時間；
③反應(yīng)產(chǎn)物立即可見,，并顯示出顏色,。
4)對照實驗：方法與鈣―鈷法相同。